2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙影响.doc

2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙影响 　 作者：周永红 陈利国 屈援 颜亮 唐海兰 程少冰 【摘要】 目的 探讨2型糖尿病患者血清干预人脐静脉内皮细胞(ECV304)对细胞骨架微丝及胞浆内游离钙浓度的影响。方法 ECV304传代后取对数生长期细胞分为正常对照组(N组)、健康人血清干预组(H组)和糖尿病患者血清干预组(MD组)。按照1×105/ml将细胞种植在Petri 皿中进行分组干预，其中健康人血清、糖尿病患者血清浓度分别占总体积的10%。采用Fluo3/AM作为荧光指示剂在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内游离钙浓度的变化，采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞骨架微丝分布的差异。结果 与N组比较MD组胞浆内荧光分布不均匀，胞浆内游离钙浓度显著升高，骨架微丝断裂，排列紊乱，少部分区域缺失。结论 糖尿病患者血清干预正常的ECV304可以造成内皮细胞的骨架结构改变，主要与细胞内游离钙浓度升高有关。 【关键词】 2型糖尿病;血管内皮细胞;细胞骨架;胞浆内游离钙 　　【Abstract】 Objective To explore the mechanisms of ECV304 incubated by the serum of patients associated with diabetes. Methods ECV304 were obtained by cultured conventionally and divided into N (control), H (cultured with the serum of healthy person) and MD (cultured with the serum of diabetes patients) groups. Model cells′ intracellular free calcium (〔Ca2+〕i) and cytoskeleton were assayed by laser scanning confocal microscope(LSCM). Results ①There was a significant difference (Plt;0.001) regarding the intracellular calcium concentration(〔Ca2+〕i) of ECV304 between MD and H, N groups.② By the cytoskeleton, MD group was significantly different with the Group N. Conclusions The serum of diabetes patients could injury ECV304 and cause model cells’ intracellular free calcium (〔Ca2+〕i) and cytoskeleton change. 　　【Key words】 Type 2 diabetes mellitus;Vascular endothelial cell;Cytoskeleton;Intracellular free calcium 　　血管内皮细胞的完整性对于维持血管的正常功能有着重要的意义，维持细胞正常的形态和完整性必须依赖细胞中存在的细胞骨架〔1〕，而细胞骨架的分布变化又受到钙离子的调节。以往研究已经观察到利用患者血清可以造成血管内皮细胞损伤〔2〕，但其机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨糖尿病患者血清干预ECV304后对于内皮细胞骨架结构的影响以及同细胞内钙离子浓度变化的关系，进一步阐明其致血管内皮细胞损伤的作用机制。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 门诊及住院确诊的2型糖尿病患者40例，诊断均符合WHO(1999)和ADA(2005)2型糖尿病诊断标准。男21例，女19例，平均年龄(68.4±7.3)岁。平均随机血糖(13.25±1.37)mmol/L，空腹血糖(8.25±0.97)mmol/L，OGTT 2h血糖(12.68±1.44)mmol/L。随机选取健康志愿者30例作为正常对照组，男18例，女12例，平均年龄(23.7±3.4)岁。平均随机血糖(5.02±0.61)mmol/L，空腹血糖(3.81±0.40)mmol/L。 　　1.2 试剂与仪器 Fluo3/AM和F127购自美国BioRad公司，罗丹明标记的鬼笔环肽(Rhodamine phalloidin)购自美国Invitiogen 公司，TritonX100和山羊血清封闭液(BSA)购自美国GIBCO公司，Hoechst购自华美生物工程公司。Phtri皿(美国Co