BALB-c鼠肝脏枯否细胞不同分离培养方法比较.doc

BALB/c鼠肝脏枯否细胞不同分离培养方法比较 　 作者：柳俊刚 高枫 张森　杨剑锋　刘传渊 【摘要】 目的 建立简便易行，存活好、产量和纯度高，稳定的枯否细胞(Kupffer Cell, KC)分离培养方法。方法 根据酶消化时间不同和裂解红细胞的方法在酶消化之后和之前分方法Ⅰ和方法Ⅱ。分别运用0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.05%链酶蛋白酶E和0.005%DnaseⅠ在不同方法中离体消化肝组织并进行密度梯度离心和贴壁培养提取KC，通过吞噬实验观察鉴定KC。结果 方法Ⅰ和方法Ⅱ中KC的数量分别是(0.71±0.21)×107/g和(0.96±0.20) ×107/g，细胞贴壁率分别40.1%、45.1%。用0.4%台盼蓝染色鉴定，存活率分别为90%、95%。吞噬实验发现，细胞纯度分别为90%、95%。结论 结合碾磨筛网滤过降低酶作用时间并在酶消化之前裂解红细胞分离提取枯否细胞具有存活好产量纯度高的优点。 【关键词】 枯否细胞;分离;鉴定;酶消化法 　　[Abstract] Objective To establish a simple, activity and highyield isolation method of Kupffer cells (KC). Methods Two methods (ⅠandⅡ) were used by the times of enzymatic digestion and cracking red blood cells after or before. KC were isolated by 0.1%CollagenaseⅡ,0.05% Pronase E and 0.005% DnaseⅠdigestion of liver, density gradient centrifugation and adherent culture, identified by the phagocytosis of ink.Results The number of KC by methodsⅠand Ⅱ were (0.71±0.21) ×107/g and (0.96± 0.20) ×107/g, cell adhesion rates were 40.1%and 45.1%.Identification by 0.4% trypan blue shows the cells survival rates were 90% and 95%.The cells purity were 90% and 95% in phagocytosis.Conclusion Combination of millingscreen filter to reduce the digestive time of enzyme and crack RBC before enzymes digestion is a good method for isolating KC. 　　[Key words] Kupffer Cells; Isolation; Identification;Enzyme Digestion 　　肝脏是肿瘤转移的好发部位，又是巨大的免疫器官，含有丰富的免疫细胞枯否细胞(KC)，它在多种因素所致的肝脏组织及继发变化起至关重要的作用。癌症的免疫治疗是目前研究的热点，能否通过激活肝脏的免疫活性达到预防和治疗肿瘤的目的，需要在体外实验分离KC并研究其活性。目前国内外存在多种分离培养KC的方法[1～4]，其中酶消化法的细胞产量、纯度及存活率还有待于提高。本实验对离体酶消化法不同过程分离培养KC方法做了比较，进一步完善了BALB/c鼠分离培养枯否细胞的方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 健康雄性8～10周龄BALB/c鼠，清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供。合格证号：SCXK桂20030003 　　1.2 主要试剂及配制 (1) 0.05%链霉蛋白酶E(Roche产品)，DHanks’液配制。(2) 0.1%Ⅱ型胶原酶(Gibco产品)，DHanks液配制。(3) 0.05%Dnase I酶(Sigma产品)，DHanks液配制, 调整PH=7.4。(4) Percoll分离液(Sigma产品)，取原液9份加1份无菌8.5%NaCl (V/V)稀释得到100%Percoll溶液，用时无菌生理盐水配成70%和30% (V/V)的浓度。(5) RPMI1640培养液(Gibco产品)，临用前加入10%新鲜灭活的胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司产品)。 (6) 0.4%台盼蓝，40 mg台盼蓝粉剂溶于10 mL生理盐水中，分装备用。 　　1.3 主要仪器 (1)净化工作台SWC