Calphostin C 逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用机制.doc

Calphostin C 逆转人肾癌内源性阿霉素耐药作用机制 　【摘要】 　　目的 探讨蛋白激酶C alpha抑制剂对肾癌细胞多药耐药（MDR）逆转作用的机制。方法 应用荧光显色法、RTPCR检测PKCα基因的表达情况及PKCα cDNA转染肾癌7860细胞前后细胞中MDR1表达的变化；采用〔14C〕ADM 标记法检测PKCα激动剂Calphostin C、抑制剂PMA作用PKCα/7860细胞系内阿霉素（ADM）浓度变化；测定PKC激动剂以及与PKC抑制剂对肾癌细胞细胞生长抑制率；分别测定ADM与PKC激动剂以及与PKC抑制剂协同作用后,7860细胞和肾癌转染细胞系PKCα/7860耐药性的变化。结果 肾癌转染细胞系PKCα/7860的MDR1表达水平高于肾癌7860细胞。Calphostin C、PMA作用后MDR1基因表达分别出现升高和降低。Calphostin C协同ADM对肾癌细胞具有较强的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖关系。ADM与PKC抑制剂协同作用的PKCα/7860细胞系耐药性明显降低。结论 PKCαcDNA的转染可以提高7860细胞的耐药性，而PKCα的选择性激动剂和选择性抑制剂则分别可以增加和逆转肾癌细胞对ADM的耐药性，其途径可能是通过促使肾癌细胞内源性ADM耐药发生变化进而影响细胞内化疗药物的浓度来实现的。 【关键词】 蛋白激酶C；多药耐药；肾癌 　　在众多肿瘤组织中，肾癌细胞存在许多独特的特征，包括出现多药耐药（MDR）、对放疗效果不佳等。肾癌细胞内源性耐药表型的出现，使其对多种化疗药物失效。蛋白激酶C（PKC)作为一类钙磷脂依赖性磷酸化酶，广泛存在于机体内并分布在几乎所有的组织和器官中。不典型PKC(aPKC)包括PKCμ，ι 和 ζ三种亚型〔1〕。本研究前期工作已经证明肾癌组织中PKCα含量异常增高〔2〕。近期研究提示PKCα伴随MDR表型而呈现高表达现象〔3〕，提示PKCα抑制剂可能有助于提高抗癌药物发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　7860人肾癌细胞，购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。PKCα要cDNA全长开放阅读框架(ORF)、羧基端融合绿色荧光蛋白(Cterminal fusion to green fluorescent protein)的表达载体pcDNADEST47、Script Firststrand Synthesis For RTPCR试剂盒、脂质体 Lipofectamine2000plus、Trizol试剂、GatewayBP和LR ClonaseTM enzyme mix购自Invitrogen公司；G418购自 Gibercol BRL公司；PKC抑制剂Calphostin C、PKC激动剂佛波醇酯 （PMA）和Adriamycin购自Sigma公司；〔14C〕Adriamycin购自GE Healthcare Life Sciences公司。Pyrobest DNA聚合酶购自Takara公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　细胞置于37℃培养，RPMI1640培养基中，加入10％胎牛血清（FBS），2 mmol/L谷氨酰胺及25 mmol/L HEPEs,置入湿润的5％CO2培养箱中培养细胞。每2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。 1.2.2 质粒构建 人PKCα cDNA采用GatewayTM技术、BP反应技术和LR反应重组技术及Pyrobest DNA聚合酶，创建羧基端融合绿色荧光蛋白表达PKCα的pcDNADEST47PKCαGFP表达载体。扩增引物：5′ATGGCTGACGTTTTCCCGGGCAA3′；5′CATACTGCACTCTGTAAGATGGGG3′。扩增片段度为2 245 bp。 　　1.2.3 基因转染及鉴定 　　取对数生长期7860细胞，以4×105/每孔接种12孔板，待完全贴壁后开始转染。以pcDNADEST47PKCαGFP表达载体作为目的基因，按以下方法进行脂质体转染：0.6 μg DNA，2 μl plus,2 μl Lipofectamine2000plus,加入无血清RPMI1640培养液至反应终体积为500 μl，吸取孔内培养液，加入转染液37℃孵育3～5 h，换含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃孵育24 h，Fluoview共焦激光扫描显微镜下，激发波长为480 nm，吸收波长为510 nm。以FITC过滤观察绿色荧光蛋白的即时表达，观察转染效率同时观察荧光在细胞内亚细胞区域的分布变化。转染48 h后，加入G418进行筛选,浓度为400 ng/ml。培养2 w,部分细胞仍