Ph（）慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F检测技术及临床应用进展.docVIP

Ph（）慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F检测技术及临床应用进展 　【摘要】 2005年以来多个研究组报道了在Ph（）慢性骨髓增殖性疾病患者的外周血和骨髓中存在JAK2V617F突变, 所用的检测方法有DNA直接测序、 序列特异性PCR、 实时定量PCR与DNA溶链曲线分析、 限制性片段长度多态性、 焦磷酸测序, 兹就这些方法的原理、 敏感性以及临床应用进行综述。 【关键词】 慢性骨髓增殖性疾病; 突变; 检测方法 慢性骨髓增殖性疾病（chronic myeloproliferative disorders, CMPDs）是一组发生在造血干细胞水平的克隆性疾病, 主要特征是骨髓一个或多个系列相对成熟的细胞的过度增殖, 外周血细胞数量增多, 常伴有肝脾肿大。其中真性红细胞增多症（polycythemia vera, PV）、 原发性血小板增多症（essential thrombocythemia, ET）、 慢性特发性骨髓纤维化（chronic idiopathic myelofibrosis, CIMF）以及慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia, CML）为经典的CMPD。除CML外, 其余几种称为经典的Ph（）的骨髓增殖性疾病［1］。2005年国外4个不同的研究小组几乎同时报道了有关JAK2基因突变在PV、 ET和CIMF发病中的作用［2, 3］, 从而揭开了Ph阴性的CMPD发病机理研究的序幕。 Jak2是JAK家族4个成员（TYK2、 JAK1、 JAK2、 JAK3）中的一员, 为非受体型酪氨酸激酶, 位于9号染色体短臂（9p24）, 在造血调节中起着重要的作用［4］。JAK2V617F是发生在造血干/祖细胞水平的体细胞功能获得性突变, 功能研究以及模式动物研究显示该突变可引起JAK2激酶及下游信号通路的持续活化, 导致细胞恶性增殖和凋亡抑制, 最终引起PV等疾病的发生［5］。但因各家采用的疾病诊断标准以及JAK2突变的检测手段不同, 患者JAK2 V617F发生率报告也不尽相同［6］。 1 DNA直接测序法 DNA直接测序（direct DNA sequencing）的基本特点: 把待测序的DNA分子进行处理, 得到每个只差1个核苷酸的一系列逐步缩短的DNA分子混合物; 通过凝胶电泳把这些DNA分子分离开来, 形成阶梯状排列的条带, 然后逐个读出DNA的碱基序列。Sanger的双脱氧核苷酸末端终止法是目前用的比较多的测序法, 原理是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ, 以单链DNA为模板合成互补的DNA链, Sanger引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂, 与脱氧核糖核苷(dNTP)不同的是, 前者的脱氧核糖的3’位置缺少一个OH, 因此不能同后续的dNTP形成磷酸二脂键, 正在增长的DNA链不可能继续延伸, 这样反应产物是一系列的核苷酸链。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP, 结果将产生4组寡核苷酸。利用荧光标记ddNTP, 将产物毛细凝胶电泳后利用标准复合波长的荧光监测器就可完成测序［7］ 。 DNA测序的优点为结果比较直接可见, 可以提供所测序列的详细资料, 但是在产生的色普图中的背景干扰比较多, 所以敏感性比较低［6］。此方法在进行研究时作用比较大, 但是在临床检测中面临着挑战。对于髓系疾病, 所取骨髓标本中常常是肿瘤组织与正常造血组织并存, 这样提取的基因中含突变的DNA的含量会较少, 尤其是纯合子比例很低的ET以及MDS, MDS的突变表型可能只在低于10％的骨髓细胞的微小克隆中表达, 这样阳性检出率会很低, 并且费时耗资, 达不到临床要求。 随着Ph阴性MPD发病机制的进一步研究, JAK2其他位点突变的报道越来越多［8-10］, 在其他恶性血液病中JAK2突变也时有报道［11］, 因此在探讨未知突变时, 尽管直接测序法存在着敏感性差的缺点, 其直观性强的优点显露无遗。 2 序列特异性PCR 序列特异性PCR(allelespecific PCR)的原理是设计两对引物, 一对为常规针对目的序列的引物, 另一对引物作为探针, 予荧光标记, 一条针对含有突变的模板, 一条针对正常的不含突变的模板。Jones等［12］设计了一对引物和一对探针。两探针引物3′的第1个碱基会在突变位点退火, 而3′端的第3个碱基故意不配对以增大特异性。再利用琼脂糖凝胶电泳区分出野生型以及突变型产物。 Jones等［12］利用这两对引物检测MPD中JAK2突变, PV中阳性检出率为81％; Baxter等［2］利用此法但是利用不同的引物检测PV中JAK2V617F的检出率为97％;