Smad4、Smad7在慢性GVHD狼疮肾炎模型小鼠肾组织异常表达.doc

Smad4、Smad7在慢性GVHD狼疮肾炎模型小鼠肾组织异常表达 　【摘要】 目的：初步探讨Smad4、Smad7蛋白在慢性移植物抗宿主病（GVHD）狼疮肾炎（LN）模型小鼠肾组织表达的变化及意义。方法：（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠12只随机分为模型组和正常对照组，于12周处死，采用RTPCR研究各组肾组织Smad4、Smad7mRNA表达水平，应用免疫组织化学方法检测Smad4、Smad7蛋白在肾脏的定位表达，并观察各组小鼠24h尿蛋白排泄量。 结果：模型组和正常对照组小鼠肾组织均检测到Smad4、Smad7蛋白及mRNA的表达，模型组Smad蛋白及mRNA的表达均显著高于正常对照组（Plt;0.05）；模型组24h尿蛋白排泄量显著高于正常对照组（Plt;0.05）。结论：Smads信号通路的异常可能参与LN的发生发展。 【关键词】 移植物抗宿主病；狼疮肾炎；Smad蛋白；小鼠 狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者最常见和最严重的并发症之一，病理改变具有多样性及非均一性，以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭，是SLE患者的主要死因之一。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，其主要的发生机制与肾小管上皮细胞转分化(transdifferentiation，EMT)、细胞外基质（ECM）沉积以及细胞内多种促纤维化信号途径被激活等有关。近年来许多研究结果表明，Smads信号通路与众多促纤维化信号途径（如TGFβ、AngⅡ、CTGF、MMP/TIMP等）之间存在交叉对话（crosstalk），该通路的功能失调在肾脏纤维化的发生发展中起着中心作用[12]，因此本研究以Smads蛋白作为切入点，观察Smad4、Smad7蛋白及其mRNA在移植物抗宿主病（GVHD）狼疮样小鼠肾组织表达的变化，初步探讨Smads蛋白是否参与介导GVHD狼疮样小鼠LN的发生发展。 　　1 对象与方法 　　1.1 研究对象8～10周龄的雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠和6～7周龄雌性DBA/2小鼠均购自中山大学医学动物中心，体重(20.17±1.20)g，饲养于东南大学医学院SPF级动物房。 　　1.2 模型的建立与分组参照文献[3]，根据完全随机设计的原则，将8～10周龄的雌性（C57BL/6J×DBA/2）F1代杂交鼠分为模型组（A组）和正常对照组（B组），每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺和淋巴结细胞制成单细胞悬液（约60%脾细胞、30%胸腺细胞和10%淋巴结细胞），用台盼蓝染色和细胞计数板计数，保证活细胞数大于95%，调整细胞浓度为50×106，分别于1、3、7、10d静脉注射于A组F1代杂交鼠体内建成GVHD LN模型。至12周处死动物，立即取下肾脏，去掉肾包膜，一部分冻于液氮中后移至-70℃低温保存，一部分置10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋，制成4μm厚的连续切片。 　　1.3 观察指标及检测方法 1.3.1 双缩脲比色法测定24h尿蛋白 将小鼠尿液经1∶5稀释后按双缩脲比色法说明书操作。 1.3.2 肾脏病理组织学检查 将小鼠肾组织切片用常规HE染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。 1.3.3 免疫组化染色检测Smad4、Smad7蛋白在肾脏的定位表达 用SP法(链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶连结法)进行免疫组化染色（试剂均购自北京中杉生物技术有限公司）。将肾组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，10%正常羊血清封闭，37℃孵育15min，分别滴加1∶150稀释的Smad4及1∶100稀释的Smad7兔抗小鼠多克隆一抗，4℃孵育过夜，再依次加入生物素偶联的羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，各37℃孵育15min，DAB（二氨基联苯胺）染色，显微镜下控制显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片镜检。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。结果在高倍镜（400倍）下随机选择20个肾小球和20个视野肾小管间质，根据染色面积和强度按下列方法进行半定量评分：0，无染色或微弱染色；1，染色面积＜25%；2,染色面积在25%～50%之间；3,50%lt;染色面积≤75%；4,染色面积＞75%。 1.3.4 RTPCR分析各组肾组织Smad4、Smad7mRNA表达水平 （1）总RNA提取：从-70℃低温冰箱中取出肾组织迅速称取100mg，加入TRIzol（深圳晶美公司）匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳，