IL12及IL10及实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病相关性.doc

IL12及IL10及实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠发病相关性 　 作者：檀国军, 徐 玉, 王秀丽, 朱一飞, 刘静, 郭力 【摘要】 目的: 探讨IL12及IL10与实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠发病的相关性。方法: 以豚鼠全脊髓匀浆与福氏完全佐剂为抗原免疫Wistar大鼠建立EAE模型。取脑、 脊髓组织石腊包埋, 病理切片, 光镜观察; 采用双抗体夹心法ELISA检测Wistar大鼠免疫后7、 14、 21 d不同时间段血清中IL12、 IL10的含量。结果: EAE组免疫后第7天IL12水平即出现明显上调, 早于临床症状的发生, 随免疫后时间的延长, IL12表达呈逐渐增高后缓慢下降的变化趋势, 并且与EAE大鼠病情评分呈明显正相关(r=0.951, Plt;0.01)。免疫后第21天EAE组IL10水平与CFA组和NS组比较明显升高(Plt;0.01)。结论: IL12和IL10分别与EAE的发病和缓解密切相关。 【关键词】 脑脊髓炎; 自身免疫性; 实验性; IL12; IL10 多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是临床常见的中枢神经系统(central nervous system, CNS)炎性脱髓鞘的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是CD4+T细胞介导的CNS自身免疫性脱髓鞘疾病, 是MS的经典动物模型。目前MS的发病机制尚不清楚, Karpus等［1］认为与Th1/Th2失衡有关。研究表明, Th1与Th2类细胞因子(cytokine, CK)的表达分别与EAE病情进展和缓解相关［2］。本研究通过观察EAE大鼠血清中IL12、 IL10水平变化, 目的在于探讨IL12及IL10与EAE发病的相关性, 以期为深入了解MS的发病机制、 探索新的有效治疗途径和病情的监测提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 雌性Wistar大鼠(72只, 6～8周龄, 体质量180～200 g)、 清洁级雌性豚鼠(5只, 体质量350～400 g)均购自河北医科大学实验动物中心。卡介苗(60 g/L)为北京生物制品所提供; 完全福氏佐剂购自美国Sigma公司; IL12、 IL10双抗体夹心ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。 1.2 方法 1.2.1 动物分组法 将健康、 雌性Wistar大鼠72只, 随机分3组: (1)EAE组, 36只, 诱导后随机分7、 14、 21 d 3个亚组, 每亚组各12只大鼠; (2)完全福氏佐剂(complete Freunds adjuvant, CFA)组: 18只, 以CFA免疫大鼠, 分组同EAE组, 每亚组各6只大鼠; (3)生理盐水(normal saline, NS)对照组: 18只, 仅注射NS, 分组同CFA组。 1.2.2 完全抗原的制备 健康350～400 g雌性豚鼠5只用100 g/L水合氯醛350 mg/kg腹腔注射至四肢瘫软, 迅速取其全脊髓。按1 g脊髓∶1 mL NS在冰槽中用超声细胞粉碎仪制成500 mL/L的豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate, GPSCH), 与等量含4 g/L卡介苗的CFA充分混合至油包水乳剂, 制成完全抗原。 1.2.3 建立EAE大鼠模型及临床评分 EAE组经大鼠四肢足垫皮下注射抗原匀浆0.4 mL/只, 佐剂组为CFA代替抗原匀浆同法注射, 正常对照组皮下均注射NS。记免疫当日为第0天, 进行临床症状评分, 参照Kono等［3］提出的标准, 分为5级: Ⅰ级动物尾部无力; Ⅱ级尾部无力+肢体无力; Ⅲ级肢体轻度麻痹; Ⅳ级肢体严重麻痹, 被动翻身后不能复原; Ⅴ级濒死状态。 1.2.4 组织病理学检查 所有动物于免疫后在不同的时间点处死, 留取血清, 麻醉后先以NS左心室冲洗, 再用40 g/L多聚甲醛灌注固定, 切取大脑视交叉层面2 mm脑组织、 小脑、 脑干、 颈膨大、 胸段及腰膨大脊髓固定于40 g/L多聚甲醛中, 石蜡包埋切片, 行HE染色。 1.2.5 ELISA检测 血清IL12、 IL10水平的表达, 用双抗体夹心ELISA检测。 1.2.6 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析, 数值用x±s表示, 单因素多组比较用方差分析, 两组之间比较用t检验, 症状评分间比较用相关分析。 2 结果 2.1 EAE大鼠的发病情况 EAE组大鼠免疫后出现精神萎靡、