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TRAIL及DDP联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞增殖作用影响 　 作者：毕林涛 高长斌 卢振霞 宿晓云 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)与顺铂(DDP)联合应用抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖的可能机制。方法 以重组载体pACCMVTRAIL转染人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat，Western印迹检测细胞中TRAIL蛋白表达情况，以及单独或联合应用TRAIL及DDP处理的各组白血病细胞中，凋亡相关蛋白caspase3、NFκB和survivin表达水平的变化。结果 DDP组及联合用药组明显抑制了survivin蛋白的表达，DDP组、TRAIL转染组及联合用药组细胞caspase3表达上调，核因子(NF)κB表达下降，且联合用药组作用强于单独用药组。结论 TRAIL和DDP可通过caspase、NFκB途径抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖，同时DDP通过对survivin的调节发挥对TRAIL的协同作用. 【关键词】 TRAIL；DDP；急性淋巴细胞白血病；凋亡机制 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL）是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的新成员，可诱导肿瘤细胞发生快速、高效的凋亡反应，而对正常细胞无明显毒性，这一特点使其成为近年来肿瘤治疗的研究热点。然而体外实验也观察到肿瘤细胞对TRAIL产生耐药的现象，因此，学者们开始探索TRAIL与其他抗肿瘤药物联合应用的价值，并探讨TRAIL耐药的可能机制。当TRAIL与一些能诱导DNA损伤的方法合用〔1，2〕，可以增强其诱导凋亡的能力。目前研究表明，TRAIL与多种药物联合应用具有协同效应，但其中确切的相互作用机制尚不清楚。本实验选择急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat作为研究对象，应用化疗药物顺铂(DDP)和pCMVTRAIL表达载体分别进行处理，观察不同药物处理组细胞中凋亡相关蛋白表达的变化，以确定TRAIL与化疗药物顺铂是否具有协同作用，并探讨其可能机制，为白血病的治疗提供新的策略和理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 RPMI 1640培养基，胎牛血清购自Gibco公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；鼠抗人TRAIL、survivin、caspase3、核因子(NF)κB单克隆抗体购自美国Santa公司；PVDF膜、ECL购自Millipore公司；顺铂注射液购自江苏豪森公司；人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat由实验室自行保存并培养；重组质粒pCMVTRAIL由本实验室自行构建并保存。 　　1.2 方法 　　1.2.1 Jurkat细胞培养及转染 人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat由本实验室常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，37℃，5% CO2培养箱中生长。取对数生长期细胞，离心后用无抗生素培养基稀释，以2×106细胞/ml 浓度接种于6孔培养板中。取4 μg质粒和10μl Lipofectamine 2000，分别稀释于250 μl不含血清和抗生素的培养液中，轻柔混匀，室温静置5 min后，将二者混匀，室温孵育20 min。将混合物滴加到培养板中，轻轻晃动，使培养液混匀。转染4 h后离心换液去除脂质体，继续培养24 h。 　　1.2.2 实验分组 分别设空白对照组、空质粒转染组、单独DDP化疗组、单独TRAIL转染组、TRAIL联合DDP化疗组。其中，DDP化疗组及TRAIL联合DDP化疗组为转染4 h换液后，加入亚细胞毒剂量浓度的DDP。 　　1.2.3 细胞总蛋白的提取 如前述，对数生长期细胞接种于6孔培养板中，分组进行转染、加药，转染24 h后，离心收集细胞。加入预冷的蛋白裂解液，14 000 r/min，4℃离心15 min，取上清为全蛋白提取物。BCA法进行蛋白定量，分装。 　　1.2.4 Western印迹检测蛋白表达变化 分别取上述分离总蛋白进行SDSPAGE，常规转膜、免疫结合，加入ECL后，曝光成像。分别对βactin、TRAIL蛋白、survivin、caspase3及NFκB进行免疫印迹分析，根据目的蛋白与内参βactin比值确定不同处理组细胞各凋亡相关蛋白表达变化。 　　2 结果 　　2.1 TRAIL蛋白表达变化 Western印迹结果显示，空白对照组、空质粒转染组，以及单独DDP化疗组中TRAIL的表达无显著差异，而单独pCMVTRAIL重组质粒转染组和联合用药组中均有较高的TRAIL蛋白表达（图1）。 　　1.空白对照组，2.空质粒转染组，3.单独DDP化疗组，4. pCMVTRAIL重组质粒转染组，5.联合