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mGITRL真核表达质粒构建及其在Lewis细胞中表达 　【摘要】 目的： 构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法： 利用PCR方法扩增mGITRL基因，克隆至pIRES2-eGFP载体，选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞，通过G418筛选，获得稳定表达细胞株。结果： 构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，基因测序与GenBank中发表的序列完全一致，体外转染Lewis细胞，经G418筛选，体外传代30代以上，RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论： 成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL，并在小鼠Lewis细胞中稳定表达，为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。 【关键词】 GITRL； 细胞转染； 肿瘤 　　［Abstract］ Objective: To construct eukaryotic expression vector containing mGITRL gene pIRES2-eGFP/mGITRL and transfect it into Lewis cell. Methods： The mGITRL gene was amplified from intermediate vector PMD18-T/mGITRL by PCR and inserted into pIRES2-eGFP vector, and the sequence of DNA was analyzed. The mGITRL gene was transfected into Lewis cell by electroporation and the positive clone was selected by G418. Results： Expression plasmid pIRES2-eGFP/mGITRL was successfully constructed, sharing 100% homology with the sequence of mRNA for mGITRL in GenBank. mGITRL gene and the protein could be detected by RT-PCR and FCM in the transfected Lewis cell. Conclusion： pIRES2-eGFP/mGITRL vector has been constructed successfully and was expressed stably in Lewis cell, which brought a foundation for further researching on its biological function. 　　［Key words］ glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand； cell transfection； tumor 　　肿瘤严重危害人类健康，免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段。研究发现调节性T细胞抑制效应性T细胞，在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，体内清除调节性T细胞则有利于抗肿瘤免疫应答［1］。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）是胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的重要表面标志，其配体（GITR ligand, GITRL）具有解除Treg免疫抑制功能的作用［2］。本研究构建pIRES2-eGFP/mGITRL真核表达质粒，体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞，为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　RPMI1640（Gibco公司），新生小牛血清（兰州民海生物有限公司），PE标记anti-mGITRL（eBioscience 公司），Trizol及逆转录试剂盒（Invitrogene公司），DNA聚合酶，dNTP，EcoRⅠ及SalⅠ核酸内切酶，DL2 000，λ-EcoT14Ⅰdigest DNA相对分子质量标准（Takara Biotec公司），PCR产物纯化试剂盒（Macherey-Nagel公司），质粒提取试剂盒（Axygen公司），大肠杆菌DH5α，Lewis细胞株以及载体pIRES2-eGFP为本室保存。 　　1.2 引物的设计与合成 　　根据基因库中小