CD4+CD25+-highCD127lowTregs及TGFβ在多发性骨髓瘤患者外周血.doc

CD4+CD25+/highCD127lowTregs及TGFβ在多发性骨髓瘤患者外周血 　 作者：韩文敏, 邱国强, 周民, 任敏, 谢晓宝 【摘要】 目的: 初步探讨CD4+CD25+/highCD127lowT调节性T细胞（Tregs）及TGFβ在不同病程阶段多发性骨髓瘤 (MM)患者外周血中的表达水平, 并研究患者血清TGFβ水平是否与CD4+CD25+/highCD127lowTregs具有相关性。方法: 流式细胞术（FCM）检测50例MM患者及30例健康志愿者外周静脉血CD4+CD25+/highCD127lowTregs细胞的比例并分析比较。ELISA法定量检测血清TGFβ的表达水平。结果: (1)化疗后组CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞的比例均显高于初诊组及正常对照组; 初诊组与正常对照组的CD4+CD25+CD127lowT细胞相比无统计学意义, 但其CD4+CD25highCD127lowT细胞明显高于正常对照组。(2)化疗后稳定期CD4+CD25+CD127lowT细胞与活动期没有差异, 但其CD4+CD25highCD127lowT细胞明显低于活动期。(3)MM各组TGFβ水平均较对照组明显升高, 但各组比较无统计学意义。(4)TGFβ与CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞的表达水平均不成相关性。结论: CD4+CD25+/highCD127low调节性T细胞MM患者外周血中比例明显升高, 且化疗及疾病进展程度可能影响其在外周血的比例。TGFβ可能不是导致其比例增加的直接原因。 【关键词】 多发性骨髓瘤; CD4+CD25+调节T细胞; TGFβ; 流式细胞术 多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者的多种免疫缺陷影响抗肿瘤免疫应答和免疫治疗, 因此深入了解骨髓瘤患者的免疫功能有利于引入和优化新的免疫治疗策略。研究表明, 肿瘤的发生与机体免疫逃避有关, CD4+CD25+Tregs是一群具有免疫负调控功能的T细胞亚群, 在维持对自身成分免疫耐受的同时, 也可能阻止了机体对自体同源肿瘤细胞的免疫, 导致肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸［1］。利用流式细胞术（FCM）检测了50例MM患者外周血CD4+CD25+/highCD127lowTregs和TGFβ的表达水平, 并将这些改变与临床资料进行比较分析, 初步探讨其与MM发生、 发展的关系及其临床意义。 1 材料和方法 1.1 材料 PE标记的鼠抗人CD25抗体, FITC标记的鼠抗人CD4抗体, Percp标记的鼠抗人CD4抗体, PE标记的鼠抗人CD127抗体, FITC标记的鼠抗人CD25抗体, PE及FITC同型对照的鼠抗人IgG1及鼠抗人 IgG2a, 和FACS Calibur流式细胞仪均为美国Becton Dickinson（BD）公司产品。TGFβ ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司。50例MM患者来自苏州大学附三院、 常州市第二人民医院、 常州市武进医院2006-12/2007-11门诊或住院治疗的患者, 所有患者均符合国内MM诊断标准［2］。其中男33例, 女17例, 年龄41～89岁, 平均年龄63岁。免疫球蛋白分型IgG20例, IgA10例, IgD2例, IgM1例, 轻链型17例。据Salmon和Durie分期Ⅰ期3例, Ⅱ期14例, Ⅲ期33例。初诊MM患者16例, 多程化疗后34例。正常对照30名, 为健康志愿者, 男18名, 女12名, 平均59（45～82）岁。均无肿瘤及自身免疫性疾病史。 1.2 方法 1.2.1 FCM检测外周血CD4+CD25+/highCD127lowTregs 所有观察对象均于清晨空腹抽取静脉血2～4 mL, EDTA抗凝。应用荧光直接标记法及FCM检测外周血CD4+CD25+Tregs细胞水平。取外周血100 μL置于FCM检测管中, 分别加入不同荧光标记的单克隆抗体(mAb)各20 μL, 4℃暗室孵育30 min后, 每管各加本实验室配制的溶血素3 000 μL, 充分打匀后置室温孵育12 min, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清加鞘液500 μL, 用FCM检测。先以前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)确定淋巴细胞群, 再以CD4+T细胞为门, 分析CD4+T细胞上CD25与CD127的表达, 计算CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞的百分比。Cellquest或WinMDI2.9软件分析数据, 记录阳性细胞百分率, 减去非特异对照