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CD14基因型及血清水平及急性心肌梗死关系 　 作者：刘忠仁 刘运广 韦叶生 潘兴寿 黄照河 蒙兰青 【摘要】 目的 研究CD14基因启动子159C/T、260C/T多态性各等位基因及基因型在急性心肌梗死（AMI）患者中的分布频率，初步分析其基因型及血清水平与AMI的相关性。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术，检测120例AMI患者及130例正常对照组CD14的基因多态性，同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清CD14水平。结果 AMI组血清CD14水平显著高于对照组(Plt;0.01)，CD14基因159C/T多态性在AMI组和正常人群中的分布差异无显著性（Pgt;0.05），而CD14基因260C/T多态性在两组人群中的分布差异存在显著性（Plt;0.05），等位基因频率的相对风险分析发现，T等位基因携带者患AMI的风险是C等位基因的1.654倍(OR=1.654，95%CI：1.161～2.356)，携带T等位基因的AMI患者血清CD14水平显著高于不携带者(Plt;0.05)。结论 CD14基因启动子260C/T多态性与AMI的发病具有相关性，其中T等位基因可能是AMI发病的遗传易感基因；携带T等位基因的个体可能通过促进CD14的高度表达进而增加了AMI的发病风险。 【关键词】 急性心肌梗死；CD14；基因多态性 　　CD14是新近几年倍受关注的一种多功能炎症细胞因子，在炎症、免疫反应及动脉粥样硬化形成中起着重要作用，并且与心血管疾病存在着密切关系〔1〕。然而，目前CD14在急性心肌梗死(AMI)中异常表达的分子遗传学机制尚不清楚。为此，本文采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）和酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法，研究CD14基因多态性及血清水平与AMI的关系，阐明其基因型与表型之间的联系，探讨AMI分子遗传学机制。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　根据1979年WHO对AMI的诊断标准，临床确诊的AMI组患者120例，男87例，女33例，年龄52～85〔平均（62.7±10.9）〕岁。健康对照组130例选自门诊健康人群的随机个体，男90例，女40例，年龄51～82〔平均（61.8±11.8）〕岁，血常规、血脂及其他生化指标均在参考范围内，心电图检查正常，均排除肝脏、肾脏、内分泌和脑血管等疾病。研究对象均为广西地区非血缘个体。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因组DNA提取 　　AMI于发作当时采血2 ml；对照组标本在清晨空腹采静脉血2 ml，用EDTAK2抗凝；采用已建立的改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，-70℃保存备用。 　　1.2.2 PCR扩增 　　参照文献〔2，3〕设计两对引物，由北京赛百盛有限公司合成。用于特异性扩增CD14基因包含159位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5′GTGCCAACAGATGAG GTTCAC3′；下游引物为：5′GCCTCTGACAGTTTATGTAATC3′；扩增CD14基因包含260位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5′TGGCCTAAGGCACTGAGGAT CAT3′；下游引物为：5′TCAGTTCCCTCCTCTGTGAACCC3′。CD14的PCR扩增反应体系均为50 μl，其中含10×PCR 缓冲液5.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μl，上、下游引物各40 pmol，模板DNA10.0 μl，TaqDNA聚合酶2.5 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至50 μl。置热循环仪(TC48/H型)中94℃预变性3 min；再按下列程序循环35次，即94℃变性45 s，59℃退火1 min，72℃延伸1 min；末次循环后，72℃延伸5 min。 　　1.2.3 扩增产物的限制性酶切 　　分别取PCR扩增产物10 μl，用5 U限制性内切酶Ava Ⅱ酶切CD14基因159位点，37℃孵育2 h；用5 U限制性内切酶Hae Ⅲ酶切CD14基因260位点，37℃孵育3 h，反应终止后，消化片段在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，苏木素尹红（EB）染色，染色后经紫外灯判断结果并拍照。 　　1.2.4 血清CD14水平的检测 　　采用ELISA测定可溶性CD14(sCD14)的血清水平，每次测定均严格按说明书操作。 　　1.2.5 血脂、脂蛋白及载脂蛋白水平测定 　　酶法测定血清总胆固醇（TC）和甘油三酯(TG)；遮蔽法直接测定高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)；载脂蛋白（apo）A，apoB用双波长免疫透射比浊法测定。以上测定均在7060型(日本)全自动生化分析仪上进行，每次测定均选用高、中、低3种质控样