TRAIL及DDP联合诱导急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡实验探究.doc

TRAIL及DDP联合诱导急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡实验探究 　 作者：毕林涛 高长斌 宿晓云 卢振霞 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与顺铂(DDP)联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用，为白血病的临床治疗提供新思路。方法 构建重组载体pACCMVTRAIL，用脂质体法进行细胞转染，MTT法检测单独或联用TRAIL及DDP处理的各组肿瘤细胞的增殖变化，FCM技术检测细胞凋亡变化。 结果 DDP组、TRAIL转染组及联合用药组细胞增殖抑制率均高于空白对照组(均P＜0.05)，且联合用药组高于单独用药组(P＜0.05)；FCM示凋亡率也明显增高。结论 TRAIL和DDP联用可抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖，具有协调作用。 【关键词】 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；顺铂；急性淋巴细胞白血病；凋亡 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL）属于Ⅱ型跨膜蛋白质，具有在体外或体内大量、快速诱导凋亡的作用。与其他可诱导凋亡的物质不同，TRAIL能够选择性杀伤肿瘤细胞，而正常细胞可逃逸其诱导凋亡的作用，这引起了众多研究者的兴趣。当TRAIL与一些能诱导DNA损伤的方法，如化疗或放疗联合应用时，可增强其诱导凋亡的能力〔1，2〕。目前国内外学者已有应用TRAIL联合顺铂、依托泊甙、阿霉素、氟尿嘧啶、丝裂霉素等化疗药物处理胶质瘤细胞、间皮瘤细胞、结肠癌细胞以及肝癌细胞的研究报道〔1，3～5〕，但联合应用诱导凋亡的机制尚未完全阐明。本研究将单独或联合使用TRAIL及化疗药物顺铂(DDP)，观察不同方案对Jurkat细胞体外增殖的抑制作用，以确定DDP与TRAIL联合应用是否具有协同效应，并对其机制进行初步探讨。 1 材料与方法 1.1 实验材料 RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；PI染色试剂盒购自北京鼎国生物科技有限公司；顺铂注射液购自江苏豪森公司；MTT购自Sigma公司；人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株由实验室自行保存并培养；重组质粒pACCMVTRAIL由本实验室自行构建并保存，已将TRAIL基因克隆至CMV启动子之后。 1.2 实验方法 1.2.1 Jurkat细胞培养及转染 人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat系本实验室常规培养，生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，37℃、5%CO2培养箱中生长。 取对数生长期细胞，离心后用无抗生素的培养基稀释，以2×106细胞/ml 浓度接种到培养板中，用Lipofectamine 2000进行转染，96孔板中每孔加入Lipofectamine 2000 0.5μl，质粒0.2 μg；6孔板每孔加入Lipofectamine 2000 10 μl，质粒4 μg。具体操作按试剂说明书进行。转染4 h后离心换液去除脂质体，继续培养24 h。 1.2.2 化疗药物亚细胞毒剂量浓度的测定 取对数生长期细胞，以2×106细胞/ml 浓度接种至96孔培养板中，每孔200 μl。加入不同浓度DDP，终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/ml，空白对照组加入等体积培养基，各组设3复孔，加药24 h后进行MTT检测。每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37℃孵育4 h，洗净孔中液体，加入200 μl DMSO，待MTT结晶充分溶解后检测各孔在490 nm处的光吸收值。选择抑制率约为10%的药物浓度为亚细胞毒剂量浓度。 细胞增殖抑制率 =（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100% 1.2.3 TRAIL、DDP对细胞增殖抑制作用的检测 分别设空白对照组、空质粒转染组、单独DDP化疗组、单独TRAIL转染组、TRAIL联合DDP化疗组。 如前述取对数生长期细胞，接种至96孔培养板中，分组进行转染。转染4 h后换液，DDP化疗组及TRAIL联合DDP化疗组加入亚细胞毒剂量浓度的DDP，空白对照组、空质粒转染组和单独TRAIL转染组加入等体积完全培养液，每组均设3个复孔。给药后24 h以MTT法测细胞增殖抑制率。 1.2.4 流式细胞技术检测细胞凋亡率 同上，对数生长期细胞接种于6孔培养板中，分组进行转染、加药。24 h后1 000 r/min离心5 min，收集各组细胞。各组细胞以冰冷PBS洗涤2次，加70%冰乙醇固定。PI染色后在流式细胞仪上进行细胞凋亡及细胞周期检测。 1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件，数据用x±s表示，进行配对设计资料t检验。 　 2 结 果 2.1 Jurkat细