Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOS m.docVIP

Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOS m 　 作者：冯荣芳 刘凌云 石卫东 李娜 冯亚青 【摘要】 目的 阐明Ⅱ组代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor 2/3，mGluR2/3）对老年性痴呆（AD）发病过程中一氧化氮（NO）的影响。方法 应用免疫组化和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR2/3阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸 (MTPG)对脑室β淀粉样肽（Aβ）注射所致的AD大鼠神经型一氧化氮合酶（nNOS）及其mRNA表达的影响。48只SD大鼠随机分为假手术组、痴呆组、痴呆组+MTPG组，每组16只。各组大鼠均在Morris水迷宫测试后常温饲养1 w后取材观察。结果 假手术组海马CA1区锥体细胞轮廓清楚，排列整齐，胞浆有较弱的nNOS表达。痴呆组nNOS表达较假手术组明显增加，同时锥体细胞数目变少，锥体神经元的轮廓、形态出现明显的损伤性改变；脑室注射mGluR2/3阻断剂MTPG，可部分阻断AD引起的nNOS表达增加，对神经元的形态也有恢复作用。原位杂交与免疫组化显示相似的变化趋势。结论 mGluR2/3参与AD发病过程，NO信号通路可能发挥重要作用。 【关键词】 脑室Aβ注射；神经型一氧化氮合酶； 代谢型谷氨酸受体；α甲基(4四唑基苯)甘氨酸;SD大鼠 代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)是脑内广泛存在的、与G蛋白偶联的膜受体，参与脑内许多生理、病理过程。研究证实， mGluRs参与脑缺血耐受的发病机制〔1〕，并在老年性痴呆(AD)的发病中起一定作用。一氧化氮 (NO) 作为非经典神经介质参与许多与谷氨酸受体激活相关的生理、病理过程〔2〕，如海马的长时程突触传递增强和小脑的长时程突触传递抑制、神经递质释放的调节、动物的学习和记忆〔3〕以及缺血耐受过程等〔4〕。本实验采用免疫组织化学和原位杂交方法，观察脑室应用Ⅱ组mGluR阻断剂α甲基(4四唑基苯)甘氨酸(MTPG)对AD发病过程中NO的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠48只，体重250～280 g（由河北医科大学实验动物中心提供)，随机分为假手术组、痴呆组和痴呆+MTPG组，每组16只。①假手术组：进行所有手术操作,注射等量蒸馏水。②痴呆组：于大鼠左侧脑室缓慢注入凝聚态β淀粉样肽（Aβ2535） （浓度为4 g/L）5 μl；③痴呆+MTPG组：大鼠左侧脑室注入A β25～35后1 w，于右侧脑室注射MTPG 0.04 mg(MTPG溶于人工脑脊液)，其他两组均右侧脑室注入等量人工脑脊液。4 w后进行Morris水迷宫检测，各组大鼠均于Morris水迷宫测试后1 w处死，其中8只用于脑组织病理学检测和免疫组化染色，8只用于原位杂交。 　　1.2 痴呆大鼠模型的复制 Aβ老化的处理：将Aβ25～35(片段序列为：HGSNKGAIIGLMOH)溶于蒸馏水(蒸馏水有利于Aβ25～35聚合)，浓度为4 g/L，在37℃保温箱中孵育4 d，使其变为凝聚态Aβ。参照文献〔5〕的方法复制痴呆大鼠模型：大鼠在10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉下，固定于江湾1型C大鼠立体定位仪上，常规消毒，切皮，暴露前囟，依据大鼠脑立体定位图谱，于前囟后0.8 mm，中线左旁开1.5 mm，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm (AP：-0.8 mm，ML：1.5 mm，DL：4.0 mm)，于左侧脑室缓慢注入凝聚态Aβ25～35 5 μl，留针5 min，缓慢撤针；对照组动物经历同样的手术程序，注射等量蒸馏水。关闭切口，待动物清醒后，送回养笼，自由饮水，饮食。MTPG右侧脑室注射：方法同上，在AD建模后1 w，于前囟后0.8 mm，中线右旁开1.5 mm)，用牙科钻开颅，切开硬膜，用微量进样器自脑表面垂直进针4.0 mm (AP:-0.8 mm，ML:1.5 mm，DL:4.0 mm)，注射MTPG(4 mg/ml，溶于人工脑脊液)，每次注射MTPG 10 μl，1 min内注完，留针5 min；其他两组动物经历同样的手术过程，分别注射等体积的人工脑脊液；注射4 w后进行Morris水迷宫测试。 　　1.3 Morris水迷宫测试 大鼠空间学习记忆能力测试采用中国医学科学院研制的大鼠Morris水迷宫装置。测试包括定向航行试验和空间探索试验。在水迷宫水槽壁上标明 4个入水点，将水槽等分为4个象限，逃避平台置于第三象限。水槽内充以洁净自来水，水面高出平台 2 cm,并加入适量奶粉使水浑浊,水温控制于（20±2）℃。实验前1 d将大鼠放入不含平台的水槽中2