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一种基于免疫印迹高通量肿瘤相关抗原筛选及鉴定方法 　 作者：李江伟, 苏幼红, 杨薇薇, 晏鹏飞, 赵银霞 【摘要】 目的: 为了分析SEREX抗原克隆在异体食管癌患者血清中和健康对照人血清中的反应情况, 我们发展了一种基于免疫印迹的高通量肿瘤相关抗原筛选和鉴定方法。方法: 采用新发展的基于免疫印迹原理的抗原克隆微阵列检测方法与传统的噬菌斑检测法对食管癌患者血清中IgG的反应情况进行了比较, 并采用两种方法分析了两个SEREX阳性克隆与40例食管癌患者血清和40例健康人血清中的IgG的阳性反应率。通过ELISA对两种方法得到的结果进行了验证。结果: 两个阳性克隆在两种检测方法中均与同一例食管癌病人血清起反应, 采用抗原克隆微阵列检测方法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为25%和37.5%, 采用噬菌斑检测法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为27.5%和 37.5%; ELISA方法检测p53和rps3两个克隆阳性率分别为25.0%和31.25%。结论: 本研究采用两种方法检测患者血清IgG反应的结果是一致的, 抗原克隆微阵列检测方法可以代替传统的噬菌斑筛选法。 【关键词】 抗原克隆微阵列检测方法; 噬菌斑筛选法; ELISA; 体液免疫; SEREX抗原 近年来, 随着基因组学和蛋白质组学研究手段在肿瘤免疫学中的应用, 一些高通量鉴定和分离肿瘤相关抗原的方法相继建立并应用, 尤其是Pfreundschuh 和Sahin等［1］发展的采用自体患者血清分析肿瘤细胞重组噬菌体 cDNA 表达文库的方法, 即SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries）技术, 是一种强有力的筛选分离肿瘤相关抗原的手段。该技术已被广泛应用于多种肿瘤, 鉴定得到了多达上千个肿瘤相关的自身抗原［2］。这些众多的由肿瘤自身抗原诱导机体产生的抗体分子为我们从体液免疫角度分析肿瘤和宿主免疫之间的联系提供了新的手段。 采用自体或异体患者血清筛选肿瘤组织cDNA文库获得的大量噬菌体阳性克隆还需要进一步分析其与肿瘤的相关性, 其中最重要的方面就是分析这些阳性克隆在异体患者血清中和健康对照人血清中的反应情况, 从而确定其作为肿瘤免疫治疗的候选抗原或作为诊断的标志物的价值。常规分析这些抗原克隆体液免疫反应的方法主要是plaque assay法和ELISA方法［3］。其中plaque assay法需要较多量的血清, 在一张转印膜上只能检测一个克隆, 并且操作费时费力。而ELISA方法虽然具有操作简单和敏感性高以及一次可检测多个抗原的优点, 但需要获得纯化的抗原, 限制了其在分析SEREX抗原体液免疫反应中的应用。最近, 我们在采用SEREX方法筛选食管癌cDNA表达文库时［4］, 采用了一种新的基于免疫印迹的检测体液免疫的方法, 可以不需要纯化的抗原, 一次可以分析大量抗原克隆, 具有高通量和操作简便等优点, 可以用于对SEREX筛选获得的抗原克隆进行初步的肿瘤体液免疫反应分析。 1 材料和方法 1.1 材料 用于检测SEREX抗原克隆抗体反应的40例食管癌患者血清和40例健康人血清均来自中国医学科学院肿瘤医院, 血清采集后保存于-80℃, 冻融不超过2次。血清使用前用偶联了大肠杆菌/噬菌体裂解液的Sepharose4B凝胶柱进行了吸收, 收集吸收后的血清, 用含有10 g/L BSA的1×TBS以最终1∶100（血清∶缓冲液, 体积比）的稀释度稀释血清, 加入0. 2 g/L的叠氮钠防腐, 4℃保存备用。用于分析的食管癌SEREX抗原, 由本实验室对食管癌cDNA文库进行SEREX筛选时获得。为含相应抗原基因片段的噬菌体。在加入IPTG诱导剂时, 其中融合的抗原基因片段可以表达相应的抗原蛋白。 1.2 方法 1.2.1 常规噬菌斑检测法（plaque assay） 将SEREX筛选最终获得的阳性重组克隆噬菌体与没有插入片段的空载噬菌体以等比例混合后, 共同铺于预先感染XL1BlueMRF宿主菌的NZY琼脂培养基平板上, 待噬菌斑刚开始长出时, 转印至经10 mmol/L IPTG浸泡的硝酸纤维素膜上37℃诱导表达8 h后, 将硝酸纤维素膜经过洗涤、 封闭后与血清室温反应1 h, 然后与1∶10 000 稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG (Sigma公司) 室温孵育1 h。经过洗涤后与NBT/BCIP底物液反应, 暗室中显色。阳性克隆与空载噬菌体噬斑的显色反应有明显差异者判断为阳性。 　 1.2.2 基于免疫印迹的抗原克隆微阵列检测方法 按照0.5 μL/点（相当于500 pfu）将各阳性克隆