丁基苯酞对老化果蝇作用实验探究.docVIP

丁基苯酞对老化果蝇作用实验探究 　 作者：陈洪 王枫 姚继国 于淼 孙晓江 【摘要】 目的 观察丁基苯酞对实验果蝇的生存时间、行为及脑组织ATP含量的影响。方法 野生及AD果蝇随机分为溶剂对照及丁基苯酞0.3、1.0、3.0、10.0 mmol/L组，给药喂养至果蝇死亡。记录生存时间，测试行为，荧光荧光素法测定脑组织ATP含量。结果 野生及AD果蝇各组间寿命分布差别无统计学意义（P=0.116，P=0.922）。野生及AD果蝇各组行为评分随时间而下降（P＜0.01），时间和各组交互作用有统计学意义（P＜0.01），随药物浓度增加行为能力下降有延缓趋势。AD果蝇丁基苯酞3.0 mmol/L组ATP量较对照组明显增加（P＜0.05）。结论 丁基苯酞能改善野生及AD果蝇的行为，增加AD果蝇脑组织ATP含量，对老化果蝇具有一定的保护作用。 【关键词】 阿尔茨海默病；丁基苯酞；黑腹果蝇；β淀粉样蛋白 Alzheimer（1906年）报道1例典型阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）至今，一百余年已经过去，AD在治疗选择上仍然捉襟见肘，面临有效治疗药物少、药物作用有限等问题，亟待发现与开发新的有效药物。丁基苯酞(Butylphthalide)，化学名消旋3正丁基苯酞（NBP），是一种国内自主研发的药物，目前主要应用于轻、中度急性缺血性脑卒中的治疗，在改善患者神经功能缺损和生活活动能力评分等方面显示出一定临床效果〔1〕。基础研究表明，NBP尚有维持线粒体复合酶活性，保护线粒体膜流动性，改善线粒体能量泵等作用〔2，3〕。基于AD线粒体损伤方面的相关实验证据〔4〕，推测NBP对AD亦可能有一定治疗或保护作用。长期以来，在AD药物筛选和机制研究中，动物模型主要是转基因鼠类动物，存在着来源困难、成本昂贵、周期长等缺点。因此引入能够过表达β淀粉样蛋白（βamyloid，Aβ）的AD果蝇作为研究的补充模型〔5〕，希望利用果蝇强大遗传工具、周期短、低成本等优势尝试将其用于NBP对AD的初步筛选。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 黑腹果蝇（Drosophila Melanogaster），野生型Canton special(CS)果蝇，elavbGal4（eb）果蝇（Gal4转录活化系统），Alz38UAS（38）果蝇（转入了人Aβ142基因UAS表达系统），由中国科学院神经科学研究所果蝇平台提供。在23℃～25℃，湿度60%～65%下，标准果蝇食物饲养。 1.1.2 药物 NBP纯度为97.01％（石药集团恩必普药业有限公司，批号M0010704270），1.0%Tween80制成不同浓度(0.3、1.0、3.0、10.0 mmol/L)乳剂，密封阴凉处储藏。 1.2 方法 1.2.1 果蝇模型 1.2.1.1 杂交获得实验果蝇 以eb雌性处女果蝇分别与CS雄性果蝇、38雄性果蝇杂交，7～9 d后移除所有亲本，观察到有子代果蝇成虫羽化为第1天，连续收集3 d雄性子1代果蝇，分别为eb/cs 雄性子1代果蝇（简称cseb，野生果蝇）、eb/38雄性子1代果蝇（简称38eb，AD果蝇），作为实验果蝇。 1.2.1.2 AD果蝇的检测 除对果蝇形态性状进行识别外，解剖果蝇脑组织，免疫组化定性检测果蝇脑组织中的Aβ表达〔6〕，在荧光显微镜下38eb中检出了Aβ的表达，cseb中未检出。见图1、图2。 1.2.1.3 实验处理 1%Tween80溶剂为对照组，药物NBP 0.3、1.0、3.0、10.0 mmol/L为干预浓度，4 g干酵母∶1 ml溶液的比例，配制糊状酵母混合物，150 μl/管的剂量均匀涂布果蝇无酵母标准食物表面，放置30 min～2 h略干后移入出生第6天（以第1天收集果蝇时间为准，下同）的实验果蝇进行药物干预，每4 d更换涂布新药物的食物。各组果蝇均饲养在23℃～25℃，湿度为60%～65%的相同环境下。 1.2.1.4 实验分组 果蝇分为生存时间观察单元、行为测量单元、ATP测量单元和备用单元。除行为测量单元设置6管外，其他单元每果蝇类型、每剂量组设置5管，每管饲养果蝇20只。期间各单元若有果蝇损失，以备用单元相同果蝇补充。 1.2.2 指标测定 1.2.2.1 生存时间 每3 d计数1次果蝇存活及死亡数，直至果蝇全部死亡〔5〕。 1.2.2.2 果蝇行为实验 利用果蝇逆重力爬行的生理特性，在暗室红光下，将20只果蝇垂直震落于一干净指管底部，迅速打开管塞，开口处对接另一只干净指管，20 s后观察并计录位于上管的果蝇数量〔5〕。爬行行为4 d测试1次，每次每管连续测量6次，记录整数平均值，实验持续到果蝇数量不足以完成实验。 1.2.2.3 脑组织