三氧化二砷抑制U266细胞增殖、诱导凋亡及及血管内皮生长因子表达.doc

三氧化二砷抑制U266细胞增殖、诱导凋亡及及血管内皮生长因子表达 　【摘要】 目的探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡的影响及与血管内皮生长因子(VEGF)表达的关系。方法四唑盐比色法(MTT)观察As2O3对U266细胞增殖的影响;缺口末端标记法(TUNEL)分析As2O3对U266细胞凋亡的影响;逆转录多聚酶链反应(RTPCR)检测2 μmol/L As2O3不同处理时间后U266细胞VEGF mRNA表达的变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测As2O3不同浓度不同处理时间对U266细胞VEGF蛋白表达的变化。结果(1)As2O3明显抑制U266细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)为2 μmol/L;(2)As2O3能诱导U266细胞凋亡,呈剂量依赖性;(3) As2O3(2,5,10 μmol/L)分别处理72 h后细胞培养上清中VEGF量呈剂量依赖性减少;(4)考虑细胞增殖对VEGF分泌的影响,2 μmol/L As2O3处理组的上清VEGF量与对照组的差别无统计学意义,RTPCR显示2 μmol/L As2O3处理的U266细胞个体VEGF mRNA的表达无变化。结论As2O3可以诱导骨髓瘤细胞凋亡,抑制其增殖。As2O3可以通过抑制细胞增殖、诱导凋亡,减少肿瘤负荷,减少VEGF总量,但是不改变细胞个体VEGF的表达。 【关键词】 砷剂 多发性骨髓瘤 细胞凋亡 血管内皮生长因子类 多发性骨髓瘤(MM)是一种单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征的浆细胞肿瘤,主要侵犯骨髓,也可侵犯髓外组织,常引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高黏滞血症及肾功能不全等一系列临床表现。目前,MM仍无法治愈。近几年来,国内外研究报道As2O3在复发和难治性MM的治疗中取得可喜疗效[1]。基础研究也发现血管内皮生长因子（VEGF）通过多种途径、多样化机制参与MM的病理形成及临床特征的产生[2]。笔者以骨髓瘤细胞株U266为体外模型,探讨As2O3对骨髓瘤细胞作用后表达的变化,分析两者关系。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1细胞株骨髓瘤细胞株U266由上海第二军医大学附属长征医院血液科侯健教授惠赠。 1.1.2主要试剂As2O3(黑龙江伊达药业公司)用注射用水稀释至1×103μmol/L(储存液),原位细胞凋亡检测试剂盒、RTPCR试剂盒(美国Promega公司),Trizol试剂(美国Invitrogene公司),人VEGF酶联免疫吸附试验试剂盒(美国Pierce公司),RPMI 1640培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。 1.2方法 1.2.1细胞培养U266细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640液,在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下的孵箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。 1.2.2MTT法检测As2O3对U266细胞增殖的影响将不同浓度As2O3处理48 h及半数抑制浓度(IC50)的As2O3处理不同时间后的样本置于酶标仪,检测光密度[D(492 nm)],每组设6个平行孔,以对照组(0 μmol/L)细胞增殖率为100％,按公式计算细胞增殖率: 细胞增殖率(%)＝[药物组D(492 nm)/对照组D(492 nm)]×100% 1.2.3TUNEL法检测原位细胞凋亡收集0,2,5,10 μmol/L As2O3处理36 h后的细胞,涂片后用新鲜配置的4 g/L多聚甲醛固定,0.2%Triton○RX100室温渗透5 min,冲洗后加入TdT反应液,37 ℃温盒孵育60 min,1×SSC枸橼酸钠缓冲液浸泡15 min终止反应,加入1∶500辣根过氧化物酶100 μL,室温反应30 min,加入DAB混合液,出现淡棕色背景后冲洗,高倍镜下观察,DAB显色后凋亡细胞呈棕褐色。 1.2.4RTPCR检测VEGF基因表达收集2 μmol/L As2O3不同处理时间组细胞,提取总RNA,按照试剂盒说明书合成cDNA。VEGF基因扩增引物及内参βactin由上海生工生物工程有限公司合成。VEGF扩增片断为VEGF121 408 bp和VEGF165 541 bp。 上游:5/gaagtggtgaagttcatggatgtc3/ 下游:5/cgatcgttctgtatcagtctttcc3/ 内参βactin基因 上游引物:5/cgctgcgctggtcgtcgaca3/ 下游引物:5/gtcacgcacgatttcccgct3/ 扩增片断为619 bp。PCR条件,VEGF 94 ℃ 30 s→64 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s,共32个循环产物,在2