丹酚酸B对人脐静脉内皮细胞株细胞血管舒缩因子影响.doc

丹酚酸B对人脐静脉内皮细胞株细胞血管舒缩因子影响 　 作者：崔广智 金树梅 范英昌 【摘要】 目的 探讨丹酚酸B对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)血管内皮细胞血管舒缩因子一氧化氮/内皮素1(NO/ET1)及血栓素/前列环素(TXA2/PGI2)系统的影响，及其抗动脉粥样硬化(AS)作用的机制。方法 通过建立肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的ECV304细胞损伤模型，放射免疫方法及硝酸还原酶法检测丹酚酸B对ECV304细胞培养液中NO、ET1及TXA2、PGI2的含量的影响。结果 丹酚酸B能够提高内皮细胞损伤时NO的含量，同时降低ET1的含量，各剂量组之间无显著差异(P>0.05)，丹酚酸B 可明显减少ECV304细胞培养液中TXA2的含量，各浓度的丹酚酸B均可明显增加ECV304细胞培养液中PGI2的含量，且低浓度的丹酚酸B作用较好。结论 丹酚酸B可通过抑制血管内皮细胞损代办处从而发挥抗AS作用。 【关键词】 丹酚酸B;ECV304;一氧化氮/内皮素;血栓素/前列环素 内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化(AS)形成的早期病变，并参与AS发生发展的全过程,目前积极探索有效防治AS的药物尤其是中草药的开发成为重要的研究领域，丹参是临床最常用的活血化瘀中药，实验证明〔1〕，丹参具有舒张血管、保护心肌、抗氧化、抗凝和保护内皮细胞的多种功效。研究证实〔2〕，丹酚酸B可呈剂量依赖性的抑制泡沫细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达,对AS有预防和治疗作用。目前研究还表明〔3〕,丹参水溶性有效成分为治疗心血管疾病的主要药效物质基础,而丹酚酸B是其中较为重要的成分之一，本文针对AS发病过程中一氧化氮(NO)、内皮素(ET1)及血栓素(TXA2)/前列环素(PGI2)系统的分泌失调起着重要作用，建立了血管内皮细胞的损伤模型，探讨丹酚酸B对内皮细胞损伤时NO、ET1及TXA2/PGI2系统影响，以阐明它在抗AS发挥的作用及机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞与培养基 人脐静脉内皮细胞株(ECV304)(submitted by K. Takahashi，National Defense Medical College. Tokorozawa，saitama，Japan);DMEM/F12培养基(GIBICO);特级胎牛血清(FBS，TBD公司产品)。 　　1.2 试剂 人重组肿瘤坏死因子(TNFα)(Peprotech EC Ltd)产品;吡咯烷二硫氨基甲酚酯(PDTC，Sigma公司提供)，丹酚酸B(国家“973”计划课题组提供); NO检测试剂盒：购于南京建成生物工程研究所;ET1、TXB2、6KetoPGF1α放射免疫分析试剂盒：购于北京北免东雅生物技术研究所。 　　1.3 仪器 γ放射免疫计数器：GC400型，中国科技大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司。 　　1.4 方法 　　1.4.1 TNFα损伤模型浓度及丹酚酸B、PDTC药物浓度筛选(MTT法) 取生长良好的细胞消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为2×105ml-1接种于96孔板，200 μl/孔。细胞贴壁长满后，换用无血清培养液进行同步化培养12 h，分别按不同浓度分组给药，同时设空白对照，每组设10个复孔，培养24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续孵育4 h终止培养，小心弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO,轻轻振荡10 min，混匀，选择570 nm波长，在酶标仪上测定各孔的OD值，然后确立TNFα损伤模型浓度及丹酚酸B、PDTC用药浓度。 　　1.4.2 细胞损伤模型建立及药物分组 将ECV304细胞悬液，接种于24孔板，调节细胞接种密度为2×105按实验分为6组，即正常对照组、模型组(TNFα 10 ng/ml)、PDTC低剂量组(1.25 μmol/L)、PDTC高剂量组(2.5 μmol/L)、丹酚酸B低、高剂量组，每组设6个复孔,待细胞长满孔底，按各剂量组加药，培养2 h后，模型组及各给药组分别加入TNFα刺激8 h，取细胞培养上清液，用硝酸还原酶法测定NO含量;用放射免疫方法测定ET1、TXB2、6KetoPGF1α含量。 　　1.5 统计学方法 采用SPSS10.0软件分析系统进行方差分析，方差齐性检验后，组间比较采用LSD法进行比较分析。 　　2 结 果 　　2.1 各组细胞上清液NO、EF1含量 用TNFα诱导人脐静脉ECV304细胞培养液中NO含量明显降低，同时ET1含量明显升高，用丹酚酸B与TNFα共同培养的ECV304培养液中，NO含量均比模型组明显升高(P<0.05)，ET1含量明显降低(P<0.01)。见表1。 　　2.2 各组