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主动脉环体外微血管生成模型发展 　 【关键词】动脉环#12539;微血管生成模型 在机体内只要有器官发生就有血管形成，主要包括血管新生（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis），这对于氧、营养素、代谢产物的输送是必需的［1］。血管新生仅发生在胚胎早期，血管生成常见于某些病理情况，如伤口愈合、肿瘤等［2］。大量的研究不断证明，血管生成在肿瘤发生、发展、浸润、转移等生物学过程发挥重要作用。为了进一步研究肿瘤血管生成及其调控机制，分析血管生成促进因子或抑制因子活性和作用的检测，验证针对血管生成进行的肿瘤治疗措施等，必须建立肿瘤血管生成的研究模型［3］。本文对肿瘤血管生成的优秀模型，主动脉环模型的发展进行综述。 1 动脉环模型发展简史 动脉环血管生成模型由Nicosia于1984年首次报道［4］。当时采用血浆凝块包埋大鼠主动脉环，发现大鼠动脉环产生微血管网络。进一步分析发现大多数动脉环培养物中，新形成的微血管跟动脉环的内皮细胞层相通。形成血管腔内表面的内皮细胞被拉长，互相交迭形成单细胞或多细胞桥。通过生成内皮细胞通路，大面积的纤维蛋白胶表面发生重构，网络和微血管形成。这种结构的形成跟血管发育的过程相同，这是最初对大鼠动脉环新生微血管的形态描述。 1987年，Nicosia报道了细胞外基质对动脉环血管新生的影响［5］。动脉环初始培养物中，内皮细胞实体芽（endothelium solid bud）的细胞外基质主要为纤粘连蛋白、V型胶原、原纤维、层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白组成的非组织沉积物、也发现了由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白构成的少量纤维。纤粘连蛋白密集，表明是培养血管发育中临时亚细胞基质的主要成分。随着培养的进行，新生微血管内皮细胞的内质网和分泌小泡中纤粘连蛋白、层粘连蛋白及Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白染色阳性，表明内皮细胞能有效合成和分泌这些物质。Nicosia认为，毛细血管发育过程中，微血管细胞外基质经历了明显的动态变化。细胞外基质的不同成分和结构，在血管生成的不同阶段，对内皮细胞行为和毛细血管形态发生起到重要作用。 1990年，Nicosia等首次将此模型应用到血管发生的研究中［6］。用纤连蛋白胶或胶原蛋白胶包埋大鼠主动脉环，用无血清MCDB 131培养基培养，主动脉环产生分枝的微血管，其血管生成作用受到自身限制。通过每天对活体培养物新生微血管计数，可进行定量分析。用不同的胶培养大鼠主动脉环，新生血管的生长曲线不同。胶原胶包埋的主动脉环，培养1周后长到顶峰，第2周开始萎缩。纤粘连蛋白胶包埋的主动脉环，能使顶峰期维持更长，而且新生血管数量是前者的230%。因此，用无血清培养基培养主动脉环，可以对新生血管定量，还能有效筛选影响血管生成的物质。此后，大量论文用此模型来筛选影响血管生成的物质［711］，尤其是抑制血管生成的物质。 2 动脉环模型的优化 动脉环模型曾经主要用于筛选血管生成抑制剂。目前，此模型经历了诸多改进，其应用方法更为灵活，应用范围日益广泛。 2.1 转基因技术的应用 动脉环模型可以研究血管生成的分子机制。Masson等［12］首次通过转基因技术，用基因缺陷的小鼠研究血管生成的分子机制。由于血管生成过程包括细胞外基质蛋白的水解，因此Masson等分别用MMP、MMP11和PAⅠ1缺陷小鼠主动脉环模型，研究了丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMP）在血管生成中的作用。结果表明，缺少MMP、MMP11不会影响血管生成。而血浆酶原活化抑制剂（PAⅠ1）的缺乏则会影响血管生成。Zhu［13］对GFPTie2转基因小鼠进行主动脉环培养时，用GFP标记新生血管，这样可以通过绿色荧光很容易地看到新生成的血管，并发现小鼠主动脉环在无血清培养基中不会自发的生长出微血管，必须添加bFGF和VEGF。1~2个月的小鼠的主动脉环比6~10个月龄小鼠主动脉环生长血管多而且快。在添加bFGF和VEGF的情况下，不同种类的小鼠主动脉环的血管生长状况也不同。Alian等［14］对大鼠主动脉环模型进行了两点改进，从而使病毒介导的基因转染更为有效：将主动脉环置于胶原薄层的上方，使之能够被病毒接近。在包埋主动脉环之前，先对主动脉环进行病毒转染。因为由于腺病毒和痘病毒载体的有效转染能够引起主动脉环死亡。因此，研究用带有VEGF和IFN基因的反转录病毒载体转染主动脉环。VEGF的高表达可以促进血管生成，而IFNβ的高表达能产生抗病毒作用。此实验系统开创了基因治疗血管疾病的新途径。 2.2 免疫组化技术的应用 Zhu等［15］将包被主动脉环的基质胶减少到25μl,直接覆盖于主动脉环上方，简化了琼脂圈的操作步骤，而且能够对长出的血管进行全标本的免疫组化。用内皮细胞标志蛋白的抗体――抗CD31和Tie2的抗体（griffonia simplicif