人核迁移蛋白单克隆抗体制备及其在人巨核细胞中表达.docVIP

人核迁移蛋白单克隆抗体制备及其在人巨核细胞中表达 　【摘要】 目的: 制备人核迁移蛋白（hNudC )的单克隆抗体（mAb）并鉴定其特性。方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET28b/hNudC, 表达带有6His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性。结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(κ) , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32; 腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg01和人脐带血来源的CD41＋巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白。结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、 天然分布及异常表达奠定了基础。 【关键词】 人核迁移蛋白; 单克隆抗体; 巨核细胞 人核迁移蛋白C 基因(human nuclear distribution C, hNudC), 定位于第1号染色体1p34p35, 编码331个氨基酸, 基因全长为8 kb。NudC进化上保守, 从构巢曲霉、 果蝇、 小鼠等生物均能找到同源物, 人类 NudC羧基末端的94个氨基酸与构巢曲霉的同源性为67%, 与果蝇的同源性为76%, 与大鼠的同源性为98%。NudC的C末端12个氨基酸, 在所有的种类中都被保留［1］。hNudC在人体组织中广泛表达, 提示hNudC具有重要的生物学功能［2］。早期的生物学活性的研究表明, hNudC与其家族成员(包括胞质动力蛋白、 肌动蛋白、 LIS1和NUDE)相互作用, 和微管一起参与细胞增殖［3］、 正常的造血［4］、 神经细胞形成等。近期研究进一步证明, hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用［5］。这些资料为 hNudC的功能研究提供了新的方向。 为了进一步研究hNudC蛋白的结构与功能, 探索hNudC对于造血细胞的增殖、 分裂的功能和影响, 迫切需要hNudC的特异性抗体, 但现在并无相应市售抗体。为此, 本研究拟用纯化的重组hNudC蛋白为免疫原, 利用经典的淋巴细胞融合技术, 建立稳定分泌特异性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株, 并对得到的mAb进行鉴定, 检测hNudC蛋白在人巨核细胞中的表达情况和亚细胞定位, 为进一步探讨hNudC蛋白的结构和功能提供工具。 1 材料和方法 1.1 材料 弗氏完全佐剂购于Sigma公司。蛋白表达载体pET28b(+) 购自Invitrogen公司; 工具酶购自MBI Fermentas公司; 质粒DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自Omega公司; 亲和层析柱TALON Spin Column购自CLONTECH公司; Dynal CD34 祖细胞分选系统 Prod.No. 113.01购自 Dynal Biotech, Norway公司。造血干细胞无血清培养液StemSpan H2000购自Stem Cell Technologies公司; 淋巴细胞分离液FicollPaqueTM Plus (1 077 g/L)购自Amersham Biosciences公司。IMDM (Iscoves Modified Dulbecco’s Medium)培养基粉末: 购自Gibco公司; 胎牛血清FBS购自Gibco公司。重组人的rhTPO购自于Sigma公司。FITC 标记的CD41 mAb、 藻红蛋白（PE）标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）、 FITC 标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）等抗体购自于Southern Biotechnology Associates公司。BALB/c小鼠和健康成年雄性Wistar大鼠由中山大学实验动物中心提供。白血病巨核细胞系Dami、 Meg01购自中国科学院上海细胞库。其他化学试剂购自Sigma 公司。 1.2 方法 1.2.1 外源基因蛋白的表达和纯化 将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3), 挑取单个克隆接种于LB/Kan (50 mg/L)培养液中, 37℃培养过夜。取上述过夜菌液按比例接种于新鲜的LB/Kan培养液, 剧烈振荡, 37℃培养2～3 h至A600为0.5～0.6, 加异丙基硫代BD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0