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人肺癌A549细胞凋亡相关基因表达及意义 　 作者：李亚荣 张捷　夏大文 唐艳 石光 刘冰 【摘要】 目的 比较耐顺铂的人肺腺癌细胞(A549DDP)凋亡相关基因的表达与亲代A549细胞的差异，探讨细胞凋亡与细胞耐药的发生机制。方法 应用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片，检测A549和A549DDP细胞相关凋亡基因表达水平。结果 A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高(Plt;0.05),二者比值上调2倍以上。结论 肺腺癌A549DDP细胞过表达上述凋亡相关基因，可能是导致细胞凋亡受抑、细胞耐药的主要原因。 【关键词】 肺癌;凋亡基因;细胞凋亡;耐药 细胞耐药是导致化疗失败的主要原因。研究发现耐药的发生与细胞凋亡基因的异常表达密切相关。采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测细胞凋亡相关基因，具有敏感性高、速度快和重复性好等优点。目前尚未见以Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测A549细胞凋亡相关基因的报道。本文采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片检测人肺腺癌亲代细胞与耐顺铂细胞(A549和A549DDP)凋亡相关基因,并对检测结果的临床意义进行初步分析，进一步探讨肿瘤细胞凋亡与耐药的发生机制。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 人肺腺癌亲代A549细胞和耐顺铂的A549DDP细胞(华西医科大学新桥医院呼吸病研究所提供)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 人肺腺癌A549与A549DDP细胞,以含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2条件下培养,每2～3 d传代1次,初始密度为2×105/ml(2 ml/6孔板)。取对数生长期细胞进行实验。 　　1.2.2 凋亡基因检测 按着Oligo GEArray基因芯片实验操作步骤进行(Oligo GEArray细胞凋亡基因芯片由上海康成生物科技有限公司提供)。 　　1.2.3 RNA 抽提 Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。 　　1.2.4 RNA质量检测 经变性琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收测定法对RNA质量进行检测。 　　1.2.5 cRNA标记与合成 首先合成cDNA，再合成cRNA，并对合成的cRNA进行标记和扩增，进而cRNA 纯化。 　　1.2.6 芯片杂交、化学发光检测、图象采集和数据分析。 　　1.3 统计学分析 采用χ2检验。 　　2 结 果 　　对芯片中114个与凋亡相关的基因检测时发现耐顺铂的A549DDP细胞表达凋亡相关基因Bcl2凋亡调节基因家族(BAD、BAG3)、caspase家族(CASP6、CARD8)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF1、TRAF3、 CD70)、肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF14、BFAR)及与肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF关联的死亡结合域(TRADD、GADD45)较亲代A549细胞显著增高(Plt;0.05)，二者比值上调2倍以上(表1)。表1 A549与A549DDP细胞凋亡相关基因表达水平上调2倍以上基因 　　3 讨 论 　　肿瘤的发生与发展是细胞增殖和凋亡平衡失调的结果。凋亡是一种程序性细胞死亡,许多信号通道介导细胞凋亡过程，凋亡相关基因表达异常与细胞凋亡受抑及细胞耐药密切相关。而耐药性又是影响肿瘤化疗效果的重要因素,化疗失败的主要原因之一就是细胞耐药。此时,药物能如期进入细胞内并损害细胞,但因与凋亡相关的基因过度表达或表达下调而致凋亡受到抑制,此种损害被转换为无效信号。本组耐顺铂的A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高，二者比值上调2倍以上，表明上述凋亡基因的过表达参与A549细胞耐药。BAD、BAG3均属Bcl2凋亡调节基因家族成员，位于细胞质内线粒体外膜，通过存在于细胞内的可变蛋白(折叠或伸展结合)和抑制Ga2+跨膜运动，增强肿瘤细胞抗氧化性能，参与细胞的抗凋亡作用，进而增加细胞对化疗药物的抵抗性〔1〕。 　　肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)是一类新近发现的细胞内信号传导的衔接蛋白。迄今为止，已发现6种不同的TRAF (TRAF1、 TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6)。作为一种衔接蛋白，TRAFs与一些细胞表面受体直接作用，介导下游信号级联反应，调节细胞生存或死亡平衡。在6种TRAFs分子中，TRAF1、TRAF3、 TRAF5在细胞的凋亡过程中起着重要的作用。 TRAF1表达相当局限，仅存在脾