纤维素酶最适反应温度地测定.doc

本科学生实验报告 学号 104120434 姓名 穆志国 学院 生命科学学院 专业、班级 10生物技术 实验课程名称 纤维素酶最适反应温度的测定 指导教师及职称 李俊俊 ＿＿＿＿ 开课时间 2012 至＿ 2013 学年＿ 下 学期 填报时间 2013 年 4 月 17 日 一、实验目的 1、了解不同温度条件对酶活性的影响 2、掌握酶最适反应温度的测定方法 二、实验原理 温度对酶促反应速率的影响有两方面：一方面，温度升高可加快分子运动速率，提高分子碰撞概率，从而使反应速率加快；另一方面，温度升高可能使酶蛋白逐步变性而失活，从而降低酶促反应速率。温度对酶促反应速率的影响是这两方面作用的综合结果。所以只有在某一温度范围内时，酶促反应速率才会随着温度的升高而升高，达到最大反应速率时的温度称为酶作用的最适温度（Optimum Temperature）。 将其它条件（如酶浓度、底物浓度、pH、反应时间等）固定在最适状态，然后在一系列不同温度条件下进行酶活力测定。绘制得到温度——酶活力曲线。 酶的最适温度并不是酶的特征常数，受其它因素的影响。 实验试剂 1、柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L pH4.（适用于酸性纤维素酶） 2、磷酸缓冲液， 0.1mol/L pH6.0（适用于中性纤维素酶） 3、CMC-Na溶液（底物溶液，pH4.8和pH6.0 ） 4、DNS试剂（CMCA-DNS） 5、纤维素酶液（ pH4.8和pH6.0） 实验仪器 1、分光光度计 2、沸水浴 3、恒温水浴（100±0.1）℃ 4、分析天平（感量0.1mg） 5、移液器 6、计时器 7、磁力搅拌器 实验方法 本实验在室温至90℃之间选择不同温度测定酶活力，以找出纤维素酶在此条件下的最适温度。 2、 待测酶液制备 称取固体纤维素酶1g，精确至0.1mg，用蒸馏水溶解，准确稀释定容 （使试样液与空白液的吸光度之差落在0.2—0.5范围内，不在此范围内，酶液要进行重新稀释），待测。 3、测定步骤 （1）取3支25mL刻度具塞试管（1支做空白管，2支做样品管）。 （2）分别向3支管中准确加入用相应pH缓冲液配制的CMC-Na溶液2.00mL 注意：加入CMC-Na溶液时应缓慢，不可粘在试管壁上。 （3）分别准确加入稀释好的待测酶液0.5mL于2支样品管中（空白管不加） 用涡旋混合器混匀。（ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺 着试管壁加入） （4）将3支试管同时置于不同温度水浴中，准确计时，反应30min，取出。 （5）迅速准确地向3支管中加入3mLDNA试剂（加液顺序和加酶液顺序相同以保证反应时间相同），振荡摇匀，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL，摇匀。将3支管同时放入沸水浴中，准确计时，煮沸10min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。 （6）以空白管调零，在分光光度计540nm波长下，用1cm比色皿，分别测量2支样品管中样液的吸光度OD值，分别记为ODE1、ODE2 ，取二者平均值。带入标准曲线方程计算酶活力。 注意：不同温度指室温、30 ℃、 40 ℃ 、 50 ℃、 60 ℃、 70 ℃、 80 ℃、 90 ℃ 4、纤维素酶酶活力计算 纤维素酶酶活力（U/g）=(K×平均OD+b) ×N / 0.5×0.5 式中： K——标准曲线的斜率 b——标准曲线的截距 N——试样的总稀释倍数 0.5——反应酶液的体积，mL 0.5——反应时间，h 酶活力的计算值保留3位有效数字 注意：同一试样两个平行测定值的相对偏差在±8%以内，二 者的平均值为最终的酶活力测定值。 5、葡萄糖标准曲线 图一:葡萄糖标准曲线 （注：在前面的实验中已经测得，可以沿用前面中实验所得的结果） 实验结果 （1）、实验所测得的数据 温度（℃） 平均OD值 平均OD值 （PH=4.8） 平均OD值 （PH=6.0） 室温（约为26℃） 0.2205 0.0685 30 0.2845 0.2475 40 0.2830 0.340 50 0.3830 0.2205 60 0.3955 0.189 70 0.5025 0.145 80 0.439 0.089 90 0.082 0.049 表一：在不同温