利凡诺对B16黑色素瘤细胞生长及MMP.2、MMP.9表达影响.docVIP

利凡诺对B16黑色素瘤细胞生长及MMP.2、MMP.9表达影响 　【关键词】 利凡诺 　　［摘要］目的: 观察利凡诺对体外培养的B16黑色素瘤细胞生长状态及基质金属蛋白酶.2（MMP.2）、基质金属蛋白酶.9（MMP.9）表达的影响，研究利凡诺的抗肿瘤转移作用。 方法: 用噻唑蓝（MTT）法检测利凡诺对B16黑色素瘤细胞的生长抑制率;酶联免疫吸附法检测细胞培养上清的MMP.2蛋白相对含量;免疫细胞化学染色检测MMP.2、MMP.9蛋白表达情况。 结果: MTT法检测结果显示，不同浓度的利凡诺对细胞都有明显抑制并伴有时间及浓度依赖性;6.25、12.5μg#12539;ml-1 的利凡诺组在72h与同时段对照组比有显著差异（Plt;0.05）;利凡诺各药物组的MMP.2、MMP.9蛋白阳性表达随药物浓度的增加而减弱。 结论: 利凡诺可以抑制B16细胞的生长，并且具有潜在的抑制肿瘤侵袭和转移的作用。 　　［关键词］ 利凡诺;B16黑色素瘤细胞;基质金属蛋白酶;转移 　　利凡诺（ethacridine）是临床常用的皮肤黏膜消毒剂和中止妊娠药，本研究组已经发现其对S.180腹水瘤（小鼠腹水瘤）和实体瘤都有明显的抑制作用1］ 。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一种降解细胞外基质的蛋白酶，在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用，尤其是MMP.2和MMP.92］ 。目前尚不清楚利凡诺能否通过影响肿瘤细胞MMPs的表达而抑制肿瘤的转移，我们通过观察利凡诺对体外培养的B16黑色素瘤细胞生长状态及MMPs表达的影响，进一步探讨利凡诺抑制肿瘤细胞生长的机制以及其临床应用的可能性。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞培养及处理 B16黑色素瘤细胞株（购自中国科学院上海细胞生物研究所）接种于含10%小牛血清和100U#12539;ml-1 青霉素、100mg#12539;ml1 链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2 恒温培养箱中培养，每隔2～3d传代1次。实验时选取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化制成单细胞悬液。 　　1.1.2 利凡诺的配制及细胞分组 每次实验加药前取利凡诺注射液［50mg#12539;（2ml） -1 ，江苏天禾制药有限公司，批号0306041］，用含5%小牛血清的RPMI1640培养液将其稀释至浓度分别为3.13、6.25、12.5μg#12539;ml-1 （按体积比为18000、14000、12000稀释）后立刻使用。细胞分组为:（1）对照组，加入与实验组等体积的RPMI1640培养液;（2）实验组，按利凡诺的浓度分为3.13、6.25、12.5μg#12539;ml-1 共3组。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞生长的形态学观察 选取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，用RPMI1640培养液稀释，细胞浓度为6×104 ml -1 ，置于饱和湿度、37℃、体积分数为0.05的CO2 恒温培养箱中培养，贴壁并生长状态良好后按照对照组与实验组进行药物处理（见1.1.2）。加药后于24、48和72h用相差显微镜观察细胞形态。实验同时选取对数生长期的内皮细胞（ECV304，人脐静脉内皮细胞）作为对照，制成细胞浓度为6×104 ml1 的单细胞悬液，按照相同方法处理。 　　1.2.2 噻唑蓝（MTT）法 选取对数生长期的细胞调节细胞浓度为6×104 ml-1 ，接种于96孔培养板内，待细胞贴壁并生长状态良好后按照对照组与实验组进行药物处理（见1.2.1），药物处理后在同样条件下培养24、48和72h后每孔加入20μl MTT（质量浓度为5g#12539;L1 ，用0.01mol#12539;L -1 的PBS配制）继续培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，在酶标仪（Multiskan MK3.353）492nm处测定光吸收值（A），每组设6个平行孔，取平均值，按以下公式计算细胞生长抑制率（P）: P=（对照孔A 492 -实验孔A 492 ）/对照孔A 492 ×100% 实验同时选取对数生长期的内皮细胞作为对照，制成细胞浓度为6×10 4 ml-1 的单细胞悬液，按照相同方法处理。 1.2.3 酶联免疫吸附（ELISA）法 采用双抗体夹心法。细胞准备和药物处理方法同上，药物处理后在同样条件下培养24、48和72h后吸取培养板内的培养上清，测培养上清中MMP.2蛋白相对含量。兔抗人MMP.2抗体（Dr Stetler Stevenson馈赠）工作浓度为11000，鼠抗人MMP.2抗体（购自福州迈新试剂公司）工作浓度为110000，羊抗兔IgG HRP