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利用基因芯片技术检测BRAF基因在胰腺癌组织中表达 　 作者：汤永辉，石欣，卫文俊，程张军，高乃荣 [摘要]目的:研究BRAF基因在正常胰腺与胰腺癌组织中表达的情况。方法: 收集正常胰腺组织3例以及胰腺癌手术切除标本6例，后者均经病理学检查证实；用TRizol法对组织进行总RNA抽提，采用无RNA酶的DNA酶Ⅰ等方法进行纯化；通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳以及Labonchip对总RNA进行质控；利用寡核苷酸芯片技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达，并且应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术加以验证。结果: 总RNA的OD260nm/OD280nm之值在1.8～2.0之间；琼脂糖凝胶电泳18s和28s电泳条带清晰，且28s和18s亮度之比≥2；Labonchip检测显示18s和28s双峰比例及位置均正常，无降解杂峰出现。芯片杂交扫描图像信号清晰，具有较低的整体背景和较高的信噪比；Ratio分析表明，BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调（Cy3/Cy5＞2.0）。 RTPCR验证了胰腺癌组织中BRAF mRNA表达上调。结论: BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调，其在胰腺癌发生发展过程中的作用机制还有待于进一步探讨。 [关键词]胰腺癌；BRAF基因；寡核苷酸芯片；逆转录聚合酶链反应 BRAF基因别名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)，Ikawa等[1]发现该基因能诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞的转化，确定其为一种癌基因，在许多肿瘤中存在BRAF基因的突变，并与细胞癌变密切相关[1-3]。该基因与各种肿瘤的关系已成为研究热点，但目前尚没有该基因在胰腺癌组织中表达水平的报道。本实验利用寡核苷酸芯片技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达情况，并用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase reaction, RTPCR)进行验证，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 临床组织标本与病人签订知情同意书后，收集东南大学附属中大医院2004年6~12月胰腺癌手术切除标本6例，所有标本均经病理学检查证实，其中男性3例, 女性3例，年龄56～71岁，平均65.2岁。临床分期采用1987年国际抗癌协会（UICC）的TNM分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期1例，Ⅲ期2例，Ⅳ期2例。正常胰腺组织3例，取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。手术切除后立即切成小块，置于-80℃保存。 1.2 试剂与仪器末端带氨基标记的寡核苷酸探针 （上海博亚公司）， UV755B型紫外分光光度计（上海精密科学仪器公司），Trizol （Sangon公司）， SuperScrip反转录酶 (Cat.NoInvitrogen公司），QIAGEN RNeasy Kit 、 QIAquick PCR purification Kit 、QIAquick Nucleotide Removal Kit （QIAGEN公司），RNA酶抑制剂 (Cat.No.D2311A)、DNase Ⅰ（Takara公司），限制性内切酶TspRI（New England Biolabs），Taq DNA 聚合酶 (Promega 公司), Cy3dCTP (Cat.No.PA53021)、Cy5dCTP (Cat.No.PA55021)（Amersham Phamacia Biotech 公司），Agilent2100分析仪、Agilent2100扫描仪（美国Agilent公司产品）等。 1.3 寡核苷酸芯片的制作基因表达谱寡核苷酸芯片由上海生物芯片公司提供，按照探针设计原则设计寡核苷酸探针，由上海博亚公司合成末端带氨基标记的寡核苷酸探针[BRAF基因（基因代码），NM_004333（GenBank号），Hs162967（Unigene号），2 513（序列长度），5′CGA GTG ATG ATT GGG AGA TTC CTG ATG GGC AGA TTA CAG TGG GAC AAA GAA TTG GAT CT3′（探针序列）]。采用同型双功能偶联剂（APSPDC）包被玻璃基片，用OmniGrid100点样仪进行点样，点样后置于42℃过夜，在55℃用 2×SSC/0.2% SDS/0.1% BSA洗片20~30 min，再用纯水洗1 min，1500 r#12539;min-1离心5 min干片，室温放置30 min，干燥器中避光保存备用。 1.4 总RNA抽提和荧光探针的制备用TRizol法对组织进行总RNA抽提，加入无RNA 酶的DNA酶Ⅰ处理，以提高样品纯度，并按QIAGEN RNeasy Kit