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利用大孔吸附树脂从葛根中分离及纯化大豆苷 　【摘要】 目的从葛根中获取高强度的大豆苷样品。方法用大孔吸附树脂进行分离，反复结晶进一步纯化。结果D101树脂适宜于大豆苷分离，30%乙醇洗脱液放置析出白色沉淀，以甲醇结晶2～3次，得针状晶体，该晶体HPLC测定大豆苷。结论该方法操作简单易行，成本低，分离大豆苷纯度高，安全性能好。纯度92.4%，收得率为3%。 【关键词】 大孔吸附树脂； 葛根； 大豆苷； 高效液相色谱； 分离纯化 葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd) Ohwi的根，为常用中药，其提取物总黄酮对高血压病、心绞痛以及突发性耳聋、耳鸣等有确切的疗效，有扩张冠状动脉血管和脑血管、促进血液循环、增强机体的免疫力作用［1，2］。葛根的主要成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元。近年来，对大豆提取物大豆异黄酮的研究发现［3，4］，大豆异黄酮对心脑血管疾病和激素依赖性肿瘤具有较好的治疗和预防作用，尤其在防癌、抗癌方面引起了各方面的广泛关注。其主要的功能成分之一为大豆苷，因而加大大豆苷研究对合理和充分利用野生葛根资源有着十分重要的现实意义。 　　对葛根提取物的研究已有大量的报道，主要集中在葛根素［5］的药效、药理、分离纯化等方面，对大豆苷的研究还很少有相关的报道。江和源［6］采用高效逆流色谱法，用醋酸乙酯-醋酸-水（5∶1∶10）为溶剂系统，从大豆异黄酮中提取了纯度为98.2%的大豆苷。本实验用大孔吸附树脂结合结晶的方法对大豆苷纯化进行了研究。 　　1 材料与仪器 　　1.1 材料葛根异黄酮粗品购于成都双流应天生化厂，其中葛根素含量为35%，大豆苷含量为6.33%。大豆苷的标样购于中国药品生物制品检定所,纯度为98%。大孔吸附树脂D101、AB-8、NKA-9、D3520、D130均购于西安蓝深吸附材料有限责任公司。 　　1.2 试剂与仪器WATERS公司高效液相色谱系统，600型控制器，996型二级管阵列检测器，717型自动进样器，MILLENNIUM32色谱工作站；电子天平(hangping FA1004,精确到万分之一)；蒸馏水为实验室自制 ；95%医用酒精；其它乙醇、甲醇等均为分析纯。 　　2 方法 　　2.1 大豆苷、葛根素、大豆苷元的测定方法按照文献［7］所提供的方法对大豆苷、葛根素、大豆苷元进行了梯度测定。 　　2.2 大孔吸附树脂的预处理严格按照产品说明书进行处理。 　　2.3 大豆苷饱和吸附量的测定准确称取已经处理过的6种干树脂各1份，每份各1 g，然后分别置于100 ml的三角瓶中，加入葛根样品液50 ml(HPLC测其浓度为C1)，在振荡器上振荡24 h，频率为120次/min，成分吸附后，过滤，HPLC测定剩余溶液中大豆苷的浓度C2，按下式计算各树脂在室温时的吸附量Q(mg大豆苷/g干树脂)。 　　Q=(C1-C2)V/W 　　Q—吸附量(mg/g)；C1，C2—吸附前后大豆苷溶液的浓度(mg/ml)；V为黄酮溶液的体积(ml)；W为树脂的质量(g)。 　　2.4 大豆苷树脂解吸率实验通过预实验得知，在梯度洗脱的条件下，30%的乙醇可以把大豆苷洗脱下来。 　　取已经计算出吸附量的树脂，分别精密加入30%的乙醇、50%的乙醇各50 ml，浸泡后振荡24 h，过滤后，测定滤液中大豆苷的浓度，根据解吸量计算出解吸率(%)。 　　解吸率(%)=［解吸量/吸附量］×100% 　　2.5 大豆苷梯度洗脱实验称取葛根异黄酮粗品20 g。置于烧杯中，用200ml的热水溶解，趁热过滤(如果过滤速度慢，可以采用抽滤的方式)。待滤液冷却后上D101树脂(44 cm×4.5 cm)，依次用1 000 ml的水、1 500 ml的10%的乙醇、1 000 ml的30%的乙醇洗脱。在30%的乙醇洗脱过程中，每100 ml接一瓶，同时用HPLC测定每瓶中大豆苷的含量，然后以HPLC的大豆苷的积分值对洗脱瓶序号做出洗脱曲线。 　　采用上述实验方法，仅把30%的乙醇改为25%的乙醇洗脱，做出洗脱曲线。 　　比较30%和25%乙醇洗脱曲线的异同。 　　2.6 大豆苷制备实验实验方法同“2.5”项。30%的乙醇洗脱液每100ml接一瓶，放置数天，观察溶液的变化。 　　2.7 大豆苷结晶实验30%乙醇洗脱液放置析出白色不溶物，HPLC测定大豆苷含量越高的洗脱瓶析出白色不溶物越多，对白色不溶物进行结晶［8］。不溶物过滤烘干后置于烧杯中，然后滴加甲醇，用水浴或加水促溶使其溶解，过滤，放置结晶。 　　　3 结果 　　3.1 大豆苷饱和吸附量的测定结果见表1。表1 不同树脂条件下大豆苷的饱和吸附量（略） 　　从表1可以看出，5种树脂的的饱和吸附量都较小，大约在30 mg大豆苷/g干树脂，不同树脂对大豆苷的吸附