化瘀理肺方对大鼠肺纤维化形成干预作用及对Smad7表达影响.docVIP

化瘀理肺方对大鼠肺纤维化形成干预作用及对Smad7表达影响 　 作者：李飞 刘世青 黄晓日 李长生 时衍同 孙清 刘群 孙德刚 鹿伟 李霞 【摘要】 　　目的 研究化瘀理肺方对大鼠肺纤维化形成的干预作用及可能作用机制。方法 将大鼠随机分为对照组、模型组、中药组、激素组，用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，经气管内插管注入博莱霉素(5 mg/kg)建立肺纤维化模型，对照组注入生理盐水0.25 ml，从造模后的第2天起分别给予化瘀理肺方药物灌胃（中药组，13 410 mg/kg）、生理盐水灌胃（对照组、模型组）、氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射（激素组，25 mg/kg）进行干预，后于给药后的第14、28天分别处死，取肺组织行苏木素伊红（HE）染色观察病理变化情况，免疫组化法测定肺组织中Smad7蛋白的表达情况。结果 中药组肺泡炎和纤维化程度明显低于模型组和激素组，中药组Smad7蛋白表达明显高于模型组和激素组（P＜0.01）。结论 化瘀理肺方对博莱霉素所致肺纤维化大鼠有一定预防性治疗作用，可能通过促进Smad7蛋白表达发挥作用。 【关键词】 肺纤维化；化瘀理肺方；smad7；组织芯片 　　肺纤维化是一种渐进性致死性疾病，发病机制尚不完全明确，目前对于肺纤维化的治疗主要是基于抑制炎症可阻止肺纤维化进展这一观念，一般采用激素治疗，但疗效甚微，仅对20%的肺纤维化患者有效，而且常常为一过性反应〔1〕，应用免疫抑制剂或细胞毒类药物对某些肺纤维化病人作为第二线药物用于治疗，不仅存在潜在的严重副作用，而且对肺纤维化治疗基本无效。化瘀理肺方是以“化瘀理肺、畅利气机”为治则组成的中药方剂，本课题拟通过动物实验研究化瘀理肺方对大鼠肺纤维化模型的干预作用，并用组织芯片和免疫组化相结合的办法检测Smad7蛋白表达，探讨其可能作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与分组 　　雄性Wistar大鼠44只，体重(180～220)g，清洁级，由山东大学试验动物中心提供，动物合格证号为ssxk(鲁动物随机分为4组：模型组（博莱霉素+生理盐水）、中药组（博莱霉素+化瘀理肺方）、激素组（博莱霉素+氢化可的松琥珀酸钠）、对照组（生理盐水+生理盐水），中药组14只，其余每组10只。 　　1.2 药品与试剂 　　化瘀理肺方由丹参、半夏、当归、水蛭、黄芪、补骨脂、薏苡仁、鱼腥草、地龙等组成，所用中药为浓缩颗粒剂，由江阴天江药业有限公司生产，生产批号为0509025，经溶解配成含生药1 341 mg/ml的溶剂，高压灭菌，4℃冰箱保存备用；注射用盐酸博莱霉素(15 mg/支)由日本化药株式会社生产，产品批号为950330，使用时以生理盐水配成1 mg/ml；氢化可的松琥珀酸钠（50 mg/支）购自天津市生物化学制药厂，产品批号Smad7抗体（0.2 ml,200 μg/ml）及链霉亲和素过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。 　　1.3 模型的建立与标本处理 　　用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔内注射麻醉，固定四肢及头部，在额镜直视下，将与1 ml注射器相连的带接头硬脊膜外麻醉导管插入气管，注入0.4%博莱霉素0.25 ml(5 mg/kg)，对照组注入生理盐水0.25 ml作为正常对照，注药后立即将动物直立旋转，使药物在肺内分布均匀。次日开始，中药组每天给予化瘀理肺方药物灌胃（13 410 mg/kg），激素组每天给予氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射(25 mg/kg)，对照组和模型组每天给予生理盐水（2 ml/只）灌胃。给药后第14和28天每组各处死5只大鼠（中药组处死7只），取右肺中叶置于10%中性甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色。 　　1.4 组织芯片的制作 　　按刘卫平等〔2〕的方法制作组织芯片，具体步骤如下：制作空白石蜡块，根据样本的数量在空白石蜡块上钻孔 (选用钻头的直径约2 mm)，在HE染色切片上选取具代表性的部位并标记，再用金属空心管(内径约2 mm)从经定位的目标石蜡块上钻取组织，并转移到已钻孔的空白石蜡块的相应位置，将蜡块置40℃烤箱内数天,使组织与石蜡充分融合，按常规方法连续切片,厚4 μｍ，裱于10%多聚赖氨酸处理的载玻片上,56℃烤片3 ｈ以上，供免疫组化染色。 　　1.5 免疫组化染色 　　免疫组化染色采用链霉亲和素生物素酶复合物(SABC)法进行，具体实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。 　　1.6 观测指标 　　1.6.1 肺泡炎、肺纤维化程度判断 　　HE切片按Szapiel等〔3〕的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度：（1）肺泡炎分级：0级:无肺泡炎(-)；1级:轻度肺泡炎(+)，受累面积小于全肺20%；2级:中度肺泡炎