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地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫方法 　【摘要】 目的 制备卫氏并殖吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COⅠ)基因和核糖体DNA第二间隔区(ITS2)地高辛标记探针,探讨其对并殖吸虫的种别鉴定和诊断的作用。 方法 利用引物分别体外扩增获得卫氏并殖吸虫目的基因后凝胶电泳鉴定并且胶回收纯化上述两个基因片段。将酶切后的COⅠ基因和ITS2基因回收,地高辛标记成探针,尼龙膜上行斑点杂交观察。 结果 COⅠ探针有较好的特异性和敏感性。ITS2探针缺乏特异性。 结论 尼龙膜斑点杂交结果显示卫氏并殖吸虫的COⅠ基因片段可以作为种群鉴定的后备探针。 【关键词】 卫氏并殖吸虫; 地高辛; DNA探针; DNA,核糖体; 序列分析,DNA; 克隆,分子; 核酸杂交; 基因 ABSTRACT: Objective To prepare digoxigenin-Paragonimus westermani COⅠ and ITS2 genes labeled probe and evaluate for species identification. Methods The genes were labeled with digoxigenin and used as probes. DNA from the various parasites and rabbit control were applied to nylon transfer membranes, hybridized with labeled probes, and visualized according to the manufacturer’s instructions. Result The COⅠ probe hybridized well with DNA from Paragonimus westermani, but not with DNA from other species. In contrast, ITS2 could hybridize with DNA from both Paragonimu westermani and other species. Conclusion The COⅠ gene of the Paragonimus westermani labeled with digoxgenin probes can be used for species identification. KEY WORDS: Paragonimus westermani; digoxin; DNA probes; DNA,ribosomal; sequence/malysis,DNA; cloning,molecular; mucleic acid hybridization; genes 并殖吸虫在全世界广泛分布,在亚洲、非洲、拉丁美洲30余国家及我国23个省市和自治区不同程度流行［1］。目前世界上报道的虫种将近50种,其中在我国报道和发现的并殖吸虫28种。对于并殖吸虫分类标准的认识不一,加之不同地区、不同宿主体内收集的虫体存在变异，标本处理和观察方法不同以及观察者的主观性等原因,造成虫种的鉴定和分类的复杂性。由于并殖吸虫致病类型多样,以及免疫学诊断与其他寄生虫之间存在较多交叉反应现象,目前尚无很好的诊断方法,误诊率达29.3％～57.6％［2］。本研究利用引物分别体外扩增获得卫氏并殖吸虫CO I基因和ITS2基因，用地高辛标记成DNA探针,利用探针和尼龙膜上已知的基因组反应来观测所获得的探针是否可以成为一种临床诊断和分类的后备探针,以进一步完善目前的诊断和分类方法。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 卫氏并殖吸虫成虫 从福建省闽清、建瓯、漳平等地采集溪蟹,分别放入研磨器中研磨捣碎,加水混匀通过40目筛过滤,过滤液置1 500 mL量杯中静置沉淀,去除上清液,镜检沉渣分离囊蚴、初步定种。将囊蚴放入生理盐水4 ℃冰箱短期保存。每只感染狗口服卫氏并殖吸虫囊蚴100个、三平正并殖吸虫囊蚴105个,每只感染大白鼠口服斯氏狸并殖吸虫囊蚴5个。3个月后检查粪便，阳性动物放血处死,相应部位检获成虫,生理盐水清洗,75％乙醇保存。 1.1.2 主要试剂和仪器 PCR反应试剂盒(美国Promega公司);胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒(上海中科开瑞公司);尼龙膜(英国Amersham公司);地高辛标记试剂盒(上海Roche公司)。PCR扩增仪(PCR System 2400,美国PE公司);半自动凝胶图像分析仪(GDS-8000,美国Ultro-Violet公司);紫外分光光度计(Ultrospec 2100pro,英国Biochrom有限公司);低温