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增龄对大鼠海马NShc蛋白影响 　 作者：胡长春 叶露梦 朱婉儿 【摘要】 目的 研究不同月龄大鼠海马NShc蛋白的表达，以及经氧化应激后NShc磷酸化水平的改变随年龄的增加而变化的规律。方法 采用蛋白免疫印迹的方法，分别分析幼年组、成年组和老年组大鼠海马NShc蛋白的表达水平，以及经H2O2刺激后NShc磷酸化水平的改变。结果 幼年组、成年组、老年组海马NShc蛋白的含量依次减少（P＜0.05），但成年组和老年组之间没有显著性差异；H2O2处理后，幼年组、成年组、老年组海马NShc蛋白磷酸化水平也依次减少（P＜0.01），而成年组和老年组之间无显著差异。结论 随着年龄的增加，海马中NShc蛋白的表达逐渐减少并且NShc蛋白的活性逐渐降低。 【关键词】 增龄；NShc；海马；氧化应激 增龄作为细胞的应激刺激，会引起一系列细胞内蛋白含量和功能的改变〔1〕。研究证明，细胞的氧化应激和细胞凋亡在机体衰老过程中起着重要作用〔2〕。NShc蛋白是近年来发现的Shc衔接蛋白家族的一员 〔3〕。研究发现，在生理条件下NShc能增强细胞的抗氧化应激作用，抑制细胞凋亡，延长细胞寿命〔4〕。但NShc蛋白在神经细胞内的表达和功能是否受增龄的影响尚不清楚。本研究将大鼠海马NShc蛋白的表达以及氧化应激后NShc磷酸化水平的改变作为观察指标，通过观察其在不同月龄大鼠中的变化规律，探讨增龄对大鼠海马NShc蛋白含量和功能的影响。 1 材料与方法 1.1 动物与分组 雄性SD大鼠，购于中国科学院上海实验动物中心。适应期7 d，自由摄食和饮水，室温24℃，光/暗周期分别为12 h (光照时间08:00～20:00)。其中分别取3、6、18个月龄大鼠为幼年组、成年组和老年组，每组5只。 1.2 试剂 羊多克隆NShc抗体购于Santa Cruz公司；鼠单克隆抗NShc抗体、抗Shc抗体、抗Sck抗体购于Transduction实验室；抗磷酸酪氨酸(pTyr)单克隆抗体4G10购于Upstate Biotechnology Inc；其他相关试剂均购于Sigma公司。 1.3 方法 1.3.1 蛋白提取和定量 大鼠在麻醉后断头，并在冰上分离出海马、嗅球、额皮质、后皮质、丘脑、下丘脑、小脑、脊髓、心脏、肝脏、肌肉组织。在冰浴中将组织标本置于1 ml裂解液中超声处理30 s，14 000 r/min离心30 s，取上清夜到0.5 ml离心管中，于-20 ℃保存。然后采用Bradford比色法进行蛋白定量。 1.3.2 H2O2处理的海马组织分离和切片制作 大鼠在无麻醉状态下断头，在冰上分离出海马，随后用McIlwain组织切块机从两个不同的方向制作厚度为300 μm的切片；37℃条件下，切片在含氧的KR缓冲液中培养1 h，恢复生理活性；每一月龄组的每只大鼠海马切片分为4组：对照组只是培养在KR缓冲液中，其余3组分别在含有1 mmol/L H2O2的KR缓冲液中处理5、15和30 min。 1.3.3 免疫沉降 取含有500 μg蛋白的大鼠海马组织蛋白上清液，在冰上加适量羊多克隆NShc抗体反应1 h，随后与G蛋白琼脂混合，放在振动平台上反应一个晚上；次日以14 000 r/min离心30 s，弃去上清夜，沉淀物用PBS清洗两次，加入50 μl 1/3 SDS2巯基乙醇上样缓冲液，于沸水中加热5 min，然后放入冰中冷却5 min 后，取14 000 r/min离心，取上清夜作为电泳样品进行免疫印迹分析。 1.3.4 免疫印迹分析 依照标准方法提取的蛋白，进行SDSPAGE电泳；然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用封闭液A（含5％脱脂奶粉的TTBS缓冲液，针对非磷酸化抗体）或封闭液B（含5％BAS的TBST缓冲液，针对磷酸化抗体）封闭1 h；按推荐浓度的第一抗体（鼠抗NShc抗体、鼠抗Sck抗体、鼠抗Shc抗体或抗pTyr抗体）室温下反应2 h，用TTBS 200 ml清洗3次；按推荐二抗(抗鼠IgGHRP)的浓度室温孵育1 h，然后同上清洗；最后加入发光底物后X光胶片感光30 min，经显影定影显现信号。 1.3.5 图象分析 X光胶片经GS800 Calibrated 图像光密度仪分析，测定目标带单位密度，并以正常对照的单位密度值为标准进行校正，定量分析磷酸化NShc蛋白和总NShc蛋白水平。磷酸化NShc蛋白量和总NShc蛋白量相除可得各个样本的磷酸化程度，所得数据除以相应月龄对照组（H2O2刺激0 min）的平均值作为 NShc磷酸化含量。 1.4 统计学分析 数据以x±s表示，SPSS13.0软件统计进行单因素方差分析，进一步的两两比较采用LSD检验。 　 2 结