实时FQ－PCR及时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎分析.docVIP

实时FQ－PCR及时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎分析 　 作者：薄红霞 冯育英 韩红燕 刘佳 摘 要 目的：探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)定量检测乙型肝炎病毒(HBV-DNA)与时间分辨荧光免疫分析法对乙型肝炎免疫标志物(HBV-M)检测对乙型肝炎实验室诊断的敏感性。方法：采用两种方法分别对800例本院传染科住院及门诊可疑病人血清标本进行检测。结果：用FQ-PCR 检测800例，HBV-DNA阳性例数602，阳性率 87.81%，用时间分辨荧光免疫分析法检测800例，HBV-M的阳性例数477，阳性率59.63%，通过χ２检检，χ２=2.98，Plt;0.05。结论：在乙型肝炎的实验室诊断中，FQ-PCR检测乙型肝炎病毒HBV-DNA更优于时间分辨荧光免疫分析法检测乙型肝炎免疫标志物HBV-M。 　　关键词 乙型肝炎；聚合酶链反应；时间分辨荧光免疫分析 　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是严重危害人类健康的病毒之一，HBV感染后参考血清免疫学标志物如HBsAg、HBsAb、HBeAg、 HBeAb、HBcAb(即乙肝两对半；HBV-M)等，它们的敏感性及特异性可满足一般临床应用。但近几年研究发现由于一些HBV变异株的出现导致临床部分患者的HBV感染复制状况难以判断，甚至漏检。定量PCR检测HBV-DNA可对乙肝患者体内HBV复制有更直接的了解，亦有利于临床对HBV感染的诊断、治疗方案的选择及疗效判定。本实验采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和时间分辨两种方法同时检测了800份肝炎患者血清，并对结果进行了对比观察，现报告如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 研究对象： 　　为2005年10月～2005年12月本院传染科住院及门诊病人800例。 　　1.1.2 试剂与仪器： 　　实时FQ－PCR试剂盒购自中山医科大学达安基因股份有限公司。DNA扩增仪为美国产ABI7000。 时间分辨荧光免疫分析法试剂盒购自上海新波技术有限公司，HBV－M仪器为上海新波生物技术有限公司生产的时间分辨荧光免疫分析。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标本采集与保存：　　　 　　无菌抽取受检者静脉血2mL，8,000rpm离心5min，吸取上清（注意勿带入红细胞）。标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测。 　　1.2.2 标本的处理和DNA的提取： 　　取血清标本50μL，加等量DNA提取液打匀，恒温金属浴10min(误差不超过1min)。10,000rpm离心5min，取上清液5μL做PCR反应。 　　1.2.3 标准品稀释和处理：严格按照HBV-DNA FQ-PCR试剂盒说明书将阳性定量质控标准品进行稀释和处理，最后与标本一同点样上机。 　　设置PCR程序为93℃2min预变性，然后按93℃45s→55℃60s ，先做10个循环，最后按93℃30s→55℃45s，做30个循环，所有检测均由同批检测人员进行操作及分析。 　　　2 结果 　　HBV-DNA定量测量结果：800例肝炎患者血清标本中，350例HBV-DNA阳性，450例阴性，阳性最低滴度为2.74×103copies/mＬ，最高滴度为8.73×108copies/mＬ。其中乙肝大三阳组HBV-DNA检出率为95.83％；乙肝小三阳组HBV-DNA 检出率为43.48％；HBsAg、HBcAb(+)组HBV-DNA检出率高达40.00％；所有HBsAb(+)组均未检出HBV-DNA；HBV-M全阴组HBV-DNA 检出率为2.17％。见表1～表3。表1 用FQ-PCR检测病人HBV-DNA的结果HBV-DNA定量测定值范围（略）注：试剂盒的检测下限lt;103为阴性。表2 用时间分辨荧光免疫分析法检测病人HBV-M的结果（略）表3 两种方法对乙型肝炎患者血清标本检验结果比较（略） 　　3 讨论 　　通过上述两种方法对800例临床血清标本的检测，FQ-PCR检测HBV-DNA的阳性检出率87.81%,用时间分辨荧光免疫分析法检测HBV-M的阳性检出率59.63%,两种方法的χ2检验,Plt;0.05,说明两种方法对乙型肝炎病毒的检测有明显的差异。 　　在216例乙肝大三阳患者血清中检出HBV-DNA阳性207例，检出率达95.83％，定量结果在1.82×106copies/mＬ～8.73×108copies/mＬ之间，说明“大三阳”与HBV-DNA是有显著相关的。但是，不同个体病毒复制程度差异较大，其中有9例HBeAg阳性但HBV-DNA定量检测结果阴性，这9例服用拉米夫啶进行抗病毒治疗者，使HBeAg阴转明显滞后，所以“大三阳”与HBV-DNA并不能划上等号，在抗病毒治疗过程中，两者均获得转阴，可认为抗病毒