小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail 1表达抑制作用.docVIP

小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail 1表达抑制作用 　作者：方开云 石明隽 肖 瑛 桂华珍 郭兵 张国忠 【摘要】 目的： 观察小干扰RNA 对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达的抑制作用及意义。方法： 将原代培养肾小管上皮细胞分为5组，（1）对照组（含糖5.5 mmol/L）；（2）高糖组（含糖25 mmol/L）；（3）Snail1 siRNA处理组，转染Snail1 siRNA，6 h后更换为高糖（含糖25 mmol/L）培养；（4）Control siRNA处理组，转染Control siRNA作为阴性对照，6 h后换为高糖（含糖25 mmol/L）培养；（5）高渗组(含甘露醇19.5 mmol/L)。72 h后收集细胞，用Western blot检测Snail 1、Vimentin蛋白表达，用半定量RTPCR检测Snail 1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP1）和纤维连接蛋白（FN）的mRNA表达。结果： 肾小管上皮细胞转染Snail1 siRNA后，与高糖组比较Snail1 mRNA和蛋白表达分别下降62%和68%（Plt;0.01）；与高糖组比较，Snail1 siRNA处理组Vimentin、FSP1、FN蛋白和（或）mRNA表达显著下调（Plt;0.01）。结论： (1)小干扰RNA 能显著抑制高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞Snail1表达；(2)Snail1参与了高糖作用下肾小管上皮细胞病理改变，并在细胞外基质的沉积中起重要作用。 【关键词】 RNA 小干扰 上皮细胞 肾小管 snail 1 波形蛋白 蛋白质类 大鼠 SpragueDawley Snail 1属于锌指转录因子Snail超家族成员，研究显示该基因在正常胚胎发育和肿瘤的浸润、转移机制中有重要作用[1，2]。报道认为Snail 1参与腹膜纤维化[3]和单侧输尿管梗阻肾脏纤维化[4]的发生。本实验前期研究发现，Snail 1蛋白在糖尿病大鼠肾小管高表达，用胰岛素将糖尿病大鼠血糖控制到正常水平后，Snail 1蛋白的表达明显减少，表明糖尿病状态促进了肾脏Snail 1的表达；并且胰岛素治疗组大鼠在肾脏Snail 1表达回降的同时，肾功能及肾脏病理改变逐渐改善，提示Snail 1与糖尿病肾病（diabetic nephnopathy,DN）的发生、发展有关[5～6]。为进一步证实这一推测，2007年7月应用小RNA干扰技术，通过特异性的Snail 1 siRNA转染原代培养肾小管上皮细胞，观察高糖刺激下Snail 1表达的变化及意义。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物 雄性SD鼠，体重（100～120）g，由贵阳医学院实验动物中心提供。 1.1.2 主要试剂 DMEM（含糖5.5mol/L）、胎牛血清（HyClone），胰蛋白酶、EDTA（Sigma）；羊抗大鼠Snail 1多克隆抗体（SC10432）、驴抗羊lgGHRP、TBS Blotto A Blocking Reagent、Snail 1 siRNA（SC38399）、siRNA Transfection Reagent（sc29528）、siRNA Transfection Medium（sc36868）、siRNA Dilution Buffer（sc29527）、Fluorescein Conjugated Control siRNA（sc36869）（Santa Cruz）；抗波形蛋白（vimentin）抗体，抗βactin抗体、SABC，DAB试剂盒(武汉博士德)。EZ Spin Column RNA Purification Kit（BBI）、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）、Snail1、Vimentin、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblastspecific protein1, FSP1）、FN和βactin PCR引物为上海生物工程有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 肾小管上皮细胞的原代培养 采用大鼠原代肾小管上皮细胞培养方法[7]，取初代细胞为实验所用。 1.2.2 细胞分组、转染 初代细胞按2×105/孔接种于6孔板中，用不含抗生素的培养基（DMEM+20%FCS）培养24 h后，分为：（1）对照组，用DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（2）高糖组，用19.5 mmol/L Dglucose+DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2%FCS培养；（3）Snail1 siRNA处理组，按操作说明转染Snail1 siRNA，6 h后换为19.5 mmol/L D