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小鼠增龄及胸腺微环境 　【摘要】 目的 观察增龄过程中小鼠胸腺微环境中胸腺上皮细胞、巨噬细胞的形态学改变以及微环境中与胸腺衰老相关的细胞因子白介素(IL)6的变化情况，进而判断胸腺微环境的变化与鼠龄的关系。方法 运用HE和电镜方法对1、6、12和16月龄小鼠胸腺形态进行观察；用免疫组化方法对四种不同月龄小鼠胸腺微环境中IL6的表达情况进行分析。结果 随着小鼠的增龄，胸腺微环境主要表现为胸腺上皮细胞不同程度的破坏和巨噬细胞的增多。不同月龄小鼠胸腺微环境中IL6的分泌强度不同。结论 小鼠胸腺微环境随鼠龄增长变化明显。胸腺微环境中IL6表达强弱与小鼠鼠龄增长呈正相关。 【关键词】 胸腺；增龄； IL6；小鼠 　　胸腺微环境由胸腺基质细胞（thymic stromacell，TSC,包括上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等），细胞外基质（ECM）以及它们所分泌的可溶性分子组成，微环境为胸腺T细胞的分化和发育提供了最适宜的生存环境〔1〕。小鼠增龄相关的退行性改变势必要影响到胸腺微环境的功能。本实验旨在通过一些实验手段来观察小鼠增龄过程中胸腺微环境的改变以及与胸腺衰老相关的细胞因子白介素(IL)6的表达情况。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　1、6、12和16月龄BALB/c小鼠各10只，由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 试剂和仪器 　　免疫组化采用兔抗小鼠IL6抗体（上海申能博彩生物科技有限公司），SABC试剂盒（武汉博士德公司）。冰冻切片机、MIAS医学图像分析管理系统以及H600透射电子显微镜（哈尔滨医科大学）。 　　1.2.2 取材 　　取前述4组BALB/c小鼠，均颈椎离断处死，颈动脉放血，快速取出胸腺。每只小鼠两叶胸腺分别置于4%多聚甲醛固定液和2.5%戊二醛固定液中，用于冰冻切片及电镜标本的制作。 　　1.2.3 冰冻切片 　　胸腺用PLP液固定6～12 h，蔗糖梯度，OCT包埋，然后进行冰冻切片，厚4 μm，用于HE染色和免疫组化实验；免疫组化染色（ABC法）采用兔抗小鼠IL6抗体作为一抗，SABC试剂盒，DAB显色，光镜观察。阴性对照用PBS代替一抗。免疫组化结果应用MIAS医学图像分析管理系统进行图像采集及分析。每张切片随机计数10个视野的阳性目标数、面密度和数密度，取其均数。 　　1.2.4 半薄、超薄切片法 　　取新鲜组织标本1 mm×1 mm×4 mm，置于4℃冰箱、2.5%戊二醛预固定液中2～4 h；再经过锇酸固定和常规电镜制作过程后进行定位、切片、醋酸双氧铀和枸橼酸铅铀双重染色，用H600透射电子显微镜观察、记录拍照。 　　1.3 统计学分析 　　用SPSS10.0统计学分析软件进行组间比较，数据用x±s表示。 　　2 结 果 　　2.1 胸腺微环境HE染色结果 　　1月龄小鼠微环境中基质细胞较少，髓质中清晰可见上皮细胞相互交织成网状，胸腺细胞嵌入其中，皮髓界限清楚。随着增龄，退化先发生于皮质，胸腺细胞的减少使微环境中基质细胞相对增多；12月龄鼠的胸腺髓质已由斑点状连成一体，微环境中细胞外基质增多，上皮细胞发生形状改变；16月龄鼠胸腺皮髓界限不清，胸腺细胞明显减少，微环境中的上皮细胞网状结构有破坏，不连续；细胞外基质明显增多，可见大量的成纤维细胞。见图1。 　　　2.2 微环境中细胞因子IL6的免疫组化结果 　　1月龄小鼠可见IL6阳性细胞在胸腺内广泛分布，髓质中较密集；皮髓交界和髓质处的阳性细胞胞体较大，呈星形多突起状、圆形或卵圆形，细胞之间可见一些阳性分泌物。随着增龄，胸腺细胞的减少使皮质中表达IL6阳性的基质细胞变得清晰，但仍呈散在分布；髓质中的阳性细胞已由斑点状连成一体，阳性细胞变得密集，有些阳性细胞呈强阳性表达。见图2。应用MIAS医学图像分析管理系统对4种月龄的小鼠进行免疫组化阳性结果分析可见，IL6随鼠龄增长而增多，但从6月龄组开始增多不很明显。见表1。表1 小鼠不同月龄组的阳性目标个数、面密度、数密度值(略) 　　2.3 透射电镜结果 　　1月龄组小鼠基质细胞处于正常状态。微环境中吞噬细胞少见。皮质区的网状细胞核大，呈圆形，可见少量的溶酶体，网状细胞的膜结构改变不明显，粗面内质网呈扩张状态，颗粒清晰，蛋白质合成功能良好；髓质区网状上皮细胞胞体较小，有突起，核形较不规则，异染色质较多，胞质电子密度较高，细胞器发育良好，有较多的游离核糖体。 12月龄组微环境中细胞出现损伤现象，但损伤程度较小。网状上皮细胞内细胞器较少，偶可见线粒体嵴断裂，空泡样变，内质网扩张、脱颗粒，高尔基扁平囊崩解，运输小泡消失，胞质内脂质颗粒也有所增加，还可见一些空囊泡；该组网状上皮细胞可见核膜下有染色质的轻度边集现象，坏死的上皮细