小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因SHP及Cyp7A1动态改变.docVIP

小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因SHP及Cyp7A1动态改变 　【摘要】 目的探讨小鼠肝脏70%切除术后再生早期,核受体SHP参与调控Cyp7A1基因表达的机制。方法应用逆转录实时定量PCR检测野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏70%切除术后1 h和6 h Cyp7A1基因和SHP基因的表达。结果2组肝脏Cyp7A1基因表达在术后1 h和6 h明显降低;SHP基因表达在术后1 h显著上升,术后6 h急剧下降。结论小鼠肝脏70%切除术后再生早期,非依赖FXR的通路参与胆酸介导的Cyp7A1基因转录的抑制。SHP可通过非FXR介导的途径参与调节Cyp7A1基因的表达。 【关键词】 肝再生 基因表达 胆固醇7α羟化酶 法尼醇 疾病模型 动物 小异二聚体伴侣(small heterodimer partner,SHP)是一种特殊的核受体,它没有DNA结合域,主要表达在肝脏。SHP通过与其他核受体家族成员的相互作用,抑制核受体介导的转录活性[1]。保持胆酸代谢平衡是维持小鼠肝脏正常再生所必需的重要条件[2]。Cyp7A1基因编码经典胆酸合成途径中的限速酶胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7αhydroxylase,Cyp7A1),其调控主要在转录水平。当核受体法呢醇Ⅹ受体(farnesoid Ⅹ receptor,FXR)被胆酸激活后,FXR上调SHP的表达,SHP继而与核受体肝脏相关同系物(liver related homologue,LRH)结合,抑制LRH转录激活Cyp7A1基因的功能[3]。FXRSHPLRH参与的通路是胆酸介导的反馈抑制Cyp7A1基因表达的重要途径。笔者以小鼠肝脏70%切除为动物模型,探讨肝脏再生的急性期,SHP是否通过上述途径参与调控Cyp7A1基因的表达。 1材料与方法 1.1动物野生型小鼠C57BL/6NCr(美国National Cancer Institute),FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠(美国Baylor医学院)。 1.2试剂TRI试剂、溴氯丙烷(美国Molecular Research Center公司),异丙醇、二乙基焦磷酰胺(美国Sigma公司),MMLV逆转录酶(美国Invitrogen公司),重组核糖核酸酶抑制剂(美国Promega公司),SYBRGreen PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)。 1.3仪器匀浆器(PTMR2100，美国Lyophiler/polytron公司),低温离心机(CS6R，美国Beckman公司),分光光度计(640B，美国Beckman公司),实时定量PCR系统(7300SYBRGreen，美国Applied Biosystems公司)。 1.4方法 1.4.1模型制备野生型小鼠和FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠均以C57BL/6 NCr为杂交背景。以12∶12 h昼夜交替作息。标准鼠类食物喂养,饮水不限。选择8~10周雄性小鼠，每组12只。行70%肝脏切除术小鼠肝脏左外叶、尾叶和中叶完全切除，保持胆囊完整。术后1 h、6 h分别处死小鼠，收取肝脏,液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱。 1.4.2肝脏总RNA抽提和cDNA合成取肝组织100 mg,在TRI试剂中匀浆,根据试剂盒方法抽提RNA。取RNA 3 μg,以OligodT为引物,在反应体系20 μL 65 ℃预变性10 min后,加入5×FS缓冲液,0.1 mol/L DTT,25 mmol/L dNTP,Rnasin和MMLV至反应体系30 min,42 ℃ 1 h。 1.4.3实时定量PCR应用快速实时定量PCR系统定量检测肝脏中CYP7A1和SHP mRNA表达。使用的正向引物(F)和反向引物(R)包括: CYP7A1(F):CAAGAACCTGTACATGAGGGAC CYP7A1(R):CACTTCTTCAGAGGCTGCTTTC SHP(F):GTCTTTCTGGAGCCTTGAGCTG SHP(R):GTAGAGGCCATGAGGAGGATTC βactin作为内对照。 1.5统计学处理使用twotailed Student’s t test进行统计学分析。 　 2结果 2.1小鼠肝脏70%切除术后1 h和6 h,野生型小鼠和FXR/小鼠肝脏Cyp7A1基因表达均明显降低(图1)。 A:野生型小鼠; B:FXR-/-小鼠. 图170%肝脏切除术后再生早期野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏Cyp7A1基因表达 2.2肝脏70%切除术后1 h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏SHP基因表达均明显上升(图2)。 A:野生型小鼠; B:FXR-/-小鼠. 图270%肝脏切除