幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA克隆表达及鉴定.docVIP

幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA克隆表达及鉴定 　 作者：谷祯梅 籍会彩 向春艳 温淑娟 【摘要】 目的 获取幽门螺杆菌（Hp）hpaA基因的序列，预测其编码蛋白hpaA作为候选疫苗的可行性，在大肠杆菌表达系统中表达hpaA。方法 提取Hp标准株NCTC11639的基因组DNA，使用PCR扩增hpaA基因，克隆入pGEMT载体中测序，并进行同源性分析。将hpaA克隆入表达载体pGEX4T1中，诱导表达，SDSPAGE电泳鉴定。结果 同源性分析表明hpaA具有很高的保守性，成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统。结论 hpaA具有高保守性，在Hp各菌株中普遍存在，是有良好应用前景的Hp候选疫苗。 【关键词】 hpaA基因； 克隆表达； SDSPAGE 【Abstract】 Objective The intention of this study can be subscribed in three aspects: obtaining the sequence of Helicobacter pylori gene hpaA,predicting whether protein hpaA has potential to become a vaccine candidate of Hp and expressing hpaA in E.coli heterogeneous expression system. Methods The hpaA gene was amplified from the genome of Hp strain NCTC11639 and then cloned into vector pGEMT. The sequence has been obtained by sequencing the recombinant vector. The pGEX4T1 was used to construct expression system in E.Coli strain BL21 and the expression result verified by SDSPAGE. Results The homogeneous analysis showed that hpaA is a highly conservative gene.An efficient and secretive expression system in BL21 was constructed. Conclusion The research indicates that hpaA is a universal and highly conservative gene and hpaA is a promising vaccine candidate of Helicobacter pylori. 【Key words】 Gene hpaA；Clone and expression；SDSPAGE 幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，并与胃腺癌和胃粘膜相关B细胞淋巴瘤的发生密切相关。如何有效控制Hp感染，一直为国内外学者所关注。目前临床上多采用抗生素治疗Hp感染，但Hp容易产生耐药性，导致抗生素治疗失效，并且Hp未能根除，大多数患者很快又旧病复发，因此开发疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。但迄今为止，尚未开发出成功Hp的疫苗，筛选合适的抗原表位仍是目前Hp疫苗研究的热点。Hp的主要粘附素为N乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(Nacetylneuraminyllactosebinding haemagglutinin，NLBH)，hpaA是其亚单位，并且作为核心组成部分，主要参与编码鞭毛鞘壳和外膜中的脂蛋白［1-3］。hpaA在Hp感染过程中不可或缺，hpaA突变的Hp菌株无法在小鼠体内定植［4］，目前hpaA的具体功能尚未阐明。本项研究旨在探讨hpaA蛋白作为抗Hp感染的候选疫苗的可行性，拟构建可高效表达hpaA的原核表达系统，并获得重组hpaA蛋白。 1 材料和方法 1.1 菌株与培养基 Hp标准株NCTC11639、大肠杆菌Top10及BL21来源于本实验室菌种库。重组大肠杆菌所用培养基为LB培养基。 1.2 实验试剂 细菌基因组提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DNA Marker均购自天为时代，一管式PCR反应体系及PCR产物纯化试剂盒购自英韦创津公司，限制性内切酶BamH I和Hind III以及低分子量蛋白质Marker购自TaKaRa公司。 1.3 扩增及克隆 设计用于扩增hpaA的引物，并