异丙酚预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血再灌注损伤保护作用.docVIP

异丙酚预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血再灌注损伤保护作用 　【摘要】 目的： 探讨不同浓度异丙酚预处理离体乳鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法： 取出生24 h以内的新生SD乳鼠的脑皮质细胞,体外培养至第7 天，随机分为5组：A组（正常对照组），B组（损伤组），C1组（1 mg/L异丙酚预处理组），C2 组（3 mg/L异丙酚预处理组）和C3组(5 mg/L异丙酚预处理组)。C1、 C2 C3组第7天予以对应浓度的药物预处理，24 h后B、 C1 、C2、 C3组予200 μmol/L谷氨酸损伤0.5 h，所有组更换正常培养液继续培养24 h；观察神经细胞存活率（MTT法）、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、细胞凋亡率、HE染色后细胞形态变化。结果： 异丙酚预处理各组MTT量不同程度高于损伤组，LDH漏出量和凋亡细胞百分比低于损伤组；HE染色后各预处理组细胞形态受损较损伤组轻，以C2组效果最佳。结论： 异丙酚提前24 h预处理离体幼鼠脑皮质细胞对脑缺血-再灌注损伤有保护作用,其中以 3 mg/L异丙酚保护效果最佳。 【关键词】 缺血预处理 脑 再灌注损伤 二异丙酚 组织器官缺血在医学临床中常见，恢复组织灌注是抢救细胞的必经之路，再灌注一方面可挽救濒临死亡的细胞，另一方面也加重细胞损伤与死亡。预处理是近20年研究减轻缺血-再灌注损伤的途径之一，它具有相对安全、使用方便、易控制等优点，所以成为近年来的研究热点。目前异丙酚预处理动物实验颇多，细胞实验尚少，2007年5月～10月通过培养乳鼠脑皮质细胞，用不同浓度的异丙酚提前24 h对其进行预处理，谷氨酸制作缺血-再灌注损伤模型，观察不同浓度的异丙酚对脑缺血-再灌注损伤的保护效果。 1 材料和方法 1.1 材料 新生SD乳鼠（出生24 h内，由贵阳医学院实验动物中心提供），DMEM/F12培养基（HyClone公司,美国），标准胎牛血清（天津市海洋生物制品科技有限公司），异丙酚（北京费森尤斯卡比医药有限公司），依达拉奉（南京先声东元制药有限公司），即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司），LDH测试盒（南京建成生物工程研究所第一分所），MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（凯基生物科技发展有限公司）。 1.2 乳鼠大脑皮层神经细胞原代培养 取出生后24 h之内的新生SD乳鼠,消毒皮肤后取双侧大脑皮质,剔除软脑膜和血管，Dhank′s液冲洗两遍，用眼科剪剪成1 mm3左右的小块，终浓度0.125%胰蛋白酶常温下消化3～5 min,同时用巴士管吹打至肉眼看不到细胞团块，立刻用培养基中止消化，200目筛网过滤成单细胞悬液，细胞计数板计数，加培养基适量，调细胞浓度为105～106/L的细胞悬液，接种于96孔培养板、24孔培养板、盖玻片、50 ml培养瓶中。置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，第3天用含2.5 mg/L阿糖胞苷[1]培养基换液,抑制神经胶质细胞及纤维细胞生长，第6天用培养基换液。 1.3 实验分组 随机分为5组：A组（正常对照组），B组（药物损伤组），C1组（1 mg/L异丙酚预处理组），C2 组（3 mg/L异丙酚预处理组）和C3组(5 mg/L异丙酚预处理组)。 1.4 大脑皮质神经细胞鉴定 脑皮质细胞体外培养至第7天,取出24孔培养板内的盖玻片，参照即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒说明书操作，然后观察。 1.5 药物预处理 脑皮质细胞体外培养至第7天，C1组、C2组、C3组弃原培养基,分别加入相应浓度异丙酚培养基，继续培养24 h。 1.6 神经细胞损伤模型[2] 培养8 d的皮层神经细胞弃原培养基,B组、C1组、C2组、C3组加入含谷氨酸（Glu）的无血清培养基(Glu终浓度200 μmol/L),作用30 min，DHank′s冲洗2遍后,所有组均更换含10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基,继续培养24 h。 1.7 检测指标（细胞生长至第9天） 1.7.1 神经细胞存活率 将接种细胞的96孔板，每孔加50 μl MTT,在37 ℃孵育4 h，使MTT还原成甲月赞，吸出上清液，每孔加150 μl二甲基亚砜（DMSO）使甲月赞溶解，轻轻震荡，使其充分溶解，酶标仪在550 nm波长处检测每孔的光吸收值（OD），减去本底OD值，计算细胞存活率。细胞存活率%=（加药组细胞OD值/对照组细胞OD值）×100%。 1.7.2 LDH漏出率 24孔培养板吸取每孔培养液，参照试剂盒说明书测定各孔中OD值；留下的24孔培养板，加培养液，量与吸取量相同，用力吹打，显微镜下见细胞基本无存活，参照试剂盒说明书测定各孔中OD值。根据公式计算LDH漏出率[3]，LDH漏出率=培养液LDH的OD值/（培养液LDH的OD值+