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第17章 高效液相色谱法(HPLC) HPLC High Performance Liquid Chromatography 17.1 概 述 17.2 高效液相色谱仪 17.3 高效液相色谱的固定相和流动相 17.4 高效液相色谱法的主要类型 17.1.3 现代高效液相色谱法的特点： (1)高效： (2)高压：HPLC工作压力高达20MPa-30MPa。 (3)高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟。 (4)高灵敏度： 紫外检测器的检测限可达10－9g， 荧光检测器的检测限可达10－11g 。 17.1.3 高效液相色谱法的优、缺点 高效液相色谱法的优点是： 其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，流动相消耗大且有毒性的居多。 17.1.4 高效液相色谱法理论基础 17.1.5 色谱分离的过程 17.1.6 样品分子在色谱柱中的分离过程 17.1.7 离子交换色谱 (Ion-exchange chromatography) 的分离原理 17.1.8 高效液相色谱法的应用 高效液相色谱的应用： 医药卫生、 食品、 17.1.8 高效液相色谱法的应用 高效液相色谱的应用： 医药卫生、 食品、 环保 等各个领域最为重要的分离分析技术。 17.1.6 高效液相色谱法的应用 17.1.6 高效液相色谱法的应用 小结 用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析的方法称为高效液相色谱法。 17.2 高效液相色谱仪结构 17.2 高效液相色谱仪结构 输液系统 17.2.1 高压输液泵 作用：将流动相以稳定的流速或压力输 送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 17.2.2 进样系统 17.2.3 分离系统： 色谱柱 常用内壁抛光过的不锈钢制成 颗粒直径早期大（20~75μm），柱管径一般为2mm，柱长为50~100cm. 近年来，用高效微型填料（3~10μm）管径为4~5mm，长为10cm~50cm的直形不锈钢柱。 每米柱效可达8万塔板数 17.2.4 检测系统 溶质性检测器有：紫外、荧光、电化学检测器等 总体检测器有：示差折光、介电常数检测器等 17.2.4 荧光检测器 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2~3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。 17.2.4 数据处理 计算机进行峰面积的积分、分析结果的计算、误差的分析或色谱图的输出，记录的信号进行程序化、自动化处理。 17.2 Main stages of HPLC analysis Prepare Sample inject into column elute with mobile phase detect sample components identify and quantify 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.2 高效液相色谱仪的工作流程 17.2 HPLC法测定人血浆中氨苄青霉素浓度 南京市儿童医院，徐进，儿科药学杂，1999年第5卷第2期色谱条件 色谱条件 : 岛津LC—10A D高效液相色谱仪； RF一l0AxL荧光检测器，荧光激发波长360nm，发射波长430nm; LD一I0A泵，分析柱为Spherisorb ODS 5μm, 200 x 4. 6mm,预柱为Waters ODS柱，室温; 流动相为0. 05mol/L磷酸盐缓冲液(pH=4. 0 ):乙腈(78:22 v/v)，内含0. 05mol/L戊磺酸钠， 流速为1 ml/min 样品分离良好，保留时间为7. 3分钟 血样处理方法 取含有氨苄青霉素的血浆0. 2m1.加人10%三氯醋酸0. 2m1，涡旋振荡混匀，12000r/min离心10min，取上清液0. 2m1于安瓿中，再加人0. 5mol/L盐酸0. 2m1，密封安瓿后置100℃水浴90min，冷却后再加人蒸馏水0. 2m1,涡旋振荡混匀后，进样20微升测定。以外标法峰面积定量。 17.4 高效液相色谱法的主要类型 分配色谱的分离原理 P1’=41%×5.8 + 59%×10.2 = 8.396 P2’=30%×5.8 + 70%×10.2 = 8.88 小结 1.高效液相色谱