华东理工 基因工程 10.ppt

A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 B 离子交换层析 C 凝胶层析 D 亲和层析 E 膜分离 F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 D 亲和层析 亲和层析的基本概念 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 亲和层析的基本特点 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制 亲和层析的基本概念 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 具有特异性亲和作用的生物分子 维生素于其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素 亲和层析的基本概念 亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连 作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有 和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结 亲和层析的基本原理 合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来 亲和层析载体的性质与选择 具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 亲和层析载体的选择 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合 偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性 亲和层析载体的性质与选择 纤维素 葡聚糖凝胶 常用的亲和层析载体 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 其它新型载体 亲和层析配基的性质与选择 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的 亲和层析配基的选择 条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物 分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配 基与生物分子之间的亲和力 亲和层析配基的性质与选择 酸酐法 N-取代羟基琥珀酰亚胺法 配基的偶联 叠氮化作用 还原性烷基化合物（西夫碱）的形成 亲和层析的基本操作 通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使与固定配 泛的是改变溶液的离子强度。 非专一性洗脱 化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低 基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广 非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发 生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定 亲和层析的基本操作 使用特异的配基作为洗脱剂 溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗 专一性洗脱 使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物 脱目标产物 亲和层析的基本操作 亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载 性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法 特殊性洗脱 体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊 10 外源基因表达产物的分离纯化 膜分离的基本原理 分离膜的主要性能 影响膜分离的因素 膜分离的基本原理 膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为 化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤 膜分离的基本定义 推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。 膜分离是利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯 膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的 膜分离的基本原理 分子级别的分离过程，分离效率高 膜分离的特点 不涉及相变，能耗低，运行成本低 膜分离为单纯物理变化，无二次污染 膜分离的基本原理 分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制 膜分离过程的重要参数 膜分离过程的推动力：静压力差、浓度差、电位差 物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制 膜分离的基本原理 根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可 膜分离的主要类型 反渗透（Reverse osmosis RO） 透析（Dialysis DS） 分成下列几类： 超滤（Uitrfiltration UF） 微滤（Microfitration MF） 电渗析（Electrodialysis EI） 膜分离的基本原理 透析（Dialysis DS） 膜分离的主要类型 透析过程使用一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理 当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧 想的半透膜 时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓 度）一侧流动，这种现象叫渗透 膜分离的基