基于PCR信号放大的微量蛋白检测技术-邻位连接延伸分析.ppt

三、国内基于PCR信号放大技术-CytoploRare CFDA 2016年01月11日批准了国内首个通过PCR信号放大检测肺癌循环肿瘤细胞试剂盒-CytoploRare ?（靶向PCR CTC）格诺思博生物科技有限公司（南通） 用途：定量检测肺癌血清中叶酸受体阳性循环肿瘤细胞，用于肺癌的辅助诊断与疗效评估。 CytoploRare ?技术特点 免疫磁珠反向富集循环细胞 循环细胞与偶联寡核苷酸探针的叶酸分子结合； 3.洗涤； 4.将与细胞结合的叶酸-寡核苷酸探针从细胞上解离下来； 5.含有寡核苷酸探针的洗脱液加入25uL的PCR mix 溶液中； 6. 进行qPCR （Taqman 探针法），计算样本中寡核苷酸的浓度；并依据标准曲线转换为CTC units相对单位。 免疫磁珠反向富集CTC检测示意图 CytoploRare ?用于临床 上图：肺癌CTC 检测在临床应用方面，灵敏度73.2%、特异性84.1%，优于其他常用标志物。 不同检测技术的比较 优点 缺点 PLA 高灵敏度 探针存在损失 PEA 高灵敏度 探针不存在损失 免疫PCR 高灵敏度 非特异性吸附、检测背景信号高 ELISA 技术平台成熟 样品量大、手工操作，干扰因素多 WB 技术平台成熟 操作复杂，难以做成商品化 总结 基于PCR信号放大检测方法，在检测特异性、灵敏度和线性范围都非常具有优势。 采用链霉亲和素与生物素系统，二抗偶联探针，利于将PLA探针形成产业化。 PCR方法的高灵敏度是一把双刃剑，可能产生较高的背景信号，这是基于PCR信号放大检测都需要考虑的重点问题。 基于PCR信号放大的检测方法通常操作过程繁琐，过程引入的变异因素较多，制约着临床实际应用；未来全自动化装置的引入（微流控芯片）或可降低这方面的影响。 谢谢 欢迎批评指正！ 基于PCR信号放大的微量蛋白检测技术 主要内容 邻位连接分析技术（proximity ligation assay） 邻位延伸分析技术（proximity extension assay） CytoploRare ?技术 一、PLA技术（邻位连接分析技术） 背景：瑞典ULF Landegren 研究小组2002年提出了一种新的蛋白体外分析方法----邻位连接技术(proximity ligation assay , PLA），通过一对亲和探针对目的分子双识别，继而产生可扩增的检测信号，从而将对蛋白质的检测转变成为对DNA 的检测，实现了微量蛋白的分析。是一种研究蛋白定量、定位、相互作用、修饰以及功能的新蛋白分析技术。 PLA反应原理 1.当识别同一抗原上的两个抗体结合到抗原，则抗体上偶联寡核苷酸序列彼此靠近。 2.溶液中可以与这两个探针末端互补的连接片段的作用下，形成有一个断裂点的dsDNA片段。 3.在DNA连接酶的作用下形成完整的dsDNA。 4.以连接完整的DNA作为模板，进行定量PCR的检测；靶抗原的浓度与DNA模板的量成比例，进行蛋白定量转化。 PLA基本过程 共分为3步： 孵育：样品与靶特异性抗体的一对邻位探针共孵育 连接：结合到同一蛋白上的邻位探针与连接片段杂交并发生邻位连接反应，形成一个环状的蛋白质一蛋白识别分子一单链DNA复合物 扩增：qPCR扩增复合物中的单链DNA部分 PLA类型 PLA可分为三种：均相（液相）、固相和原位。 均相（液相），待测样品、探针、荧光PCR引物以及连接试剂加入同一管中进行荧光定量PCR，适用于微量蛋白质的快速检测。 固相，待测蛋白预先固定于微孔板上，洗涤去除未结合分子，去除游离探针，检测含量过低的蛋白。 原位，邻位探针与待测的2个具有相互作用的蛋白质分子分别结合，反应体系中加入的DNA短序列与探针上的DNA链互补，在连接酶的作用下形成环状DNA，RCA扩增。蛋白互作、细胞或组织内定位的PLA方法。 PLA PLA类型 根据抗体类型：直接PLA与间接PLA A图直接PLA，B图间接PLA，区别在于间接法用到的探针为二抗连接的亲和探针，一抗为捕获抗体。 PLA技术检测蛋白的核心 邻位探针：不同的DNA单链与一对蛋白识别分子相结合形成，使其通过免疫吸附的方式结合到待测蛋白上。 为什么说PLA的核心是一对邻位探针？ 1.DNA与蛋白结合效率低。 2.通过筛选（指数富集配体系统进化技术SELEX）技术，难以得到与蛋白分子高特异性、高亲和力的核酸适体。 3.核酸适体的种类有限，难以满足PLA实验要求。 以上三个原因，限制了PLA的发展应用 PLA探针的发展 探针的发展： 核酸适体：从一个体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选出与靶分子特异性结合的