赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因地克隆、表达及其细胞毒性地研究.pdf

赖型钩端螺旋体017 株外膜蛋白LipL32 基因的克隆、 表达及其细胞毒性的研究* △ 黄毕，鲍朗 ，钟琪，商正玲，张会东，王中平 四川大学华西基础医学与法医学院，成都（610041 ） E-mail ：baolang@ 摘 要：目的 克隆、表达LipL32 基因并研究其细胞毒性。方法 从钩体017 株全基因组中 用PCR 方法扩增出目的基因，双酶切构建重组质粒，转化大肠杆菌，诱导表达LipL32 ，将 表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，Western blotting 鉴定其免疫原性。将 目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304 细胞，通过检测细胞的乳酸脱氢酶（LDH ）、一氧化 氮（NO ）释放量研究其细胞毒性。结果 扩增出816bp 的LipL32 基因，重组质粒经双酶切、 PCR 鉴定、测序结果表明重组载体构建成功。经IPTG 诱导表达的融合蛋白约52KD,主要以 包涵体的形式表达，经免疫动物制备得到多克隆抗体，ELISA 检测效价达 1：32000 ， Western blotting 显示在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过LipL32 蛋白作用的ECV304 细胞 LDH 、NO 释放量和对照组比较有明显升高。结论 LipL32 能在大肠杆菌中表达，表达的目 的蛋白对细胞有毒性效应。 关键词：钩端螺旋体，外膜蛋白LipL32 ，表达，细胞毒性 中图分类号：R 377.5 由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病（钩体病）是世界范围内广泛分布的人兽共 患自然疫源性疾病。人主要通过接触被钩端螺旋体污染的水源、土壤等被感染，感染后的症 状轻重不一，从无症状到发热、黄疸、肝肾功能衰竭以至于肺弥漫性大出血（Pulmonary diffuse haemorrhage,PDH ），死亡率可达到 5%～10%。家畜感染钩体后可出现流产、不育、奶量下 降甚至死亡，因此钩体病是危害农民身体健康和畜牧业的严重疾病。尽管我国目前钩体病的 发病率和死亡率有所下降，但是随着环境条件的变化（如洪灾等自然灾害）极有可能导致钩 体病的爆发流行，同时钩体的流行菌群的基因突变也给防治工作带来了极大的困难。因此， 钩体病仍然威胁着农牧业，国家卫生部门已将钩体病列为重点监控的传染病。钩体病的致病 机制尚未阐明，研究发现钩端螺旋体的毒力因子（包括溶血素、脂多糖、热休克蛋白、鞭毛 蛋白、外膜蛋白等）在钩体的致病过程中扮演着重要的角色。特别是外膜蛋白，由于其位置 的特殊性，在钩体的黏附、免疫及致病中起着十分重要的作用。LipL32 是钩体含量最高的 外膜蛋白，基因序列在各种血清型中高度保守，同源性在 93 ％～99 ％之间，本研究首次从 我国特有的钩体强毒株 017 株中克隆、表达LipL32 ，并将该蛋白作用于细胞研究其细胞毒 性效应，为进一步研究该蛋白的功能及钩体的致病机制奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 钩端螺旋体017 株，本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。原核表达质粒 pET32a(+) 、宿主菌Ecoli.JM109 、ECV304 细胞本研究室保存。限制性核酸内切酶、DNA 连 接试剂盒为晶美公司产品；PCR 试剂购自Invitrogen 公司；DNA 提取试剂盒、胶回收试剂 盒购自Tiangen 公司；二抗（羊抗兔IgG-HRP ）、DAB 显色液为北京中衫公司产品；蛋白纯 * 本课题得到国家自然科学基金项目）和教育部博士点基金项目（20040610049 ）的资助。 ∆ Corresponding author. - 1 - 化柱购自 GE 公司； LDH 、NO 检测试剂盒购于南京建成生物公司；其余试剂均为国产或 进口分装（分析纯）。 1.2 方法 1.2.1 根据GenBank 中LipL32 基因序列设计引物：上游和下游引物分别引入Kpn I 和EcoR I