层析介质，层析填料.ppt

如何选择凝胶？ 五大类层析方法 - 1. 凝胶过滤 ( GC) 2. 离子交换 ( IEX) 3. 亲和层析 ( AC) 4. 疏水层析 ( HIC) 5. 反相层析 ( RPC) 介质 - 颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高 (SOURCE介质例外) 物理稳定性 - 新一代介质较坚固，能承受高流速，同时保持柱床体积和结构稳定，省却每次重新装柱，提高重复性 化学稳定性 - 新一代介质能承受极端pH，高盐度，促溶剂和有机溶剂，利于开发分离条件和在位清洗(CIP)，大大延长介质寿命和提高重复性 BioProcess 凝胶 特别适合生产应用, 特点包括： 高重复性：适用于任何规模的工艺放大 高物理、化学稳定性：易于清洗、消毒及再生、介质 寿命特长 高动力载量、流速快：缩短生产周期和次数，节省凝 胶用量(尤其XL介质，载量可比普通介质高达10倍！) 每种凝胶均有完整的文献、档案和Regulatory Support File 用空柱子须留意 使用调节器( flow adaptor ) - 保护柱床的同时更可提高 分辨率，节省凝胶 柱子物料须生物兼容，并有尤良的化学抗性 加上装柱器( packing reservoir )，可一步把凝胶装满柱 子，大大提高柱效，尤其是凝胶过滤柱 柱子的过滤网孔径应该是凝胶颗粒的1/3, 一般10um孔 径就够用，如用SOURCE15介质装HR柱和XK柱，须换上5um的网 XK柱完全配合AKTA及各种自装的凝胶，是最佳的选 择 线性流速 对体积不同的柱子来说，体积流速不能直接用作比较， 一般都换算成线性流速，再作比较： 体积流速 ( ml/min ) x 60 线性流速 (cm/hr) = ---------------------------------------- 柱子横切面积 (cm2) 线性流速 (cm/hr) x柱子横切面积 (cm2 ) 体积流速 ( ml/min ) = ---------------------------------------- 60 装柱检测 检测装柱效果一般用0.5% (~30um介质)或2% (~90um 介质) 柱体积的1%丙酮测柱效和峰形 柱效 HETP=L/N L:柱床高度 N=理论塔板数 N/m=5.54 X (Ve/W1/2)2 * (100/L) 每米理论塔板数 Ve:保留体积 W1/2:半峰高峰宽 选择层析方法 若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法： 用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose, Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白， 一步即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质 偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质 体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯化；高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化 疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品又可直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用 准备工作 考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济 蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点 蛋白的疏水性 蛋白的特异结合 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 粗提: 离子交换填料 粗提: 疏水层析填料 高载量 高流速 HiPrep? 16/10 Phenyl (高 低取代) HiPrep 16/10 Butyl HiPrep 16/10 Octyl 中度纯化 目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 中度纯化: 离子交换填料 中度纯化:疏水层析填料 目的 达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术: 凝焦过滤/离子交换 / 疏水层析/反相层析 精细纯化: 凝胶过滤填料 精细纯化:离子交换和疏水层析填料 SOURCE 介质：高流速、低反压 精细纯化:反相层析填料 SOURCE? 层析柱的种类 C柱系列 简易层析柱，无夹套及flow adaptor XK柱系列 标准层析柱 Tricorn(HR)柱系列 高压层析柱（最大10Mpa） SR柱系列 耐有机溶剂层析柱 凝胶与层析柱配套 凝胶过滤 (GF) Superdex Peptide - 纯化小生物分子的新选择 市面上唯一分离范围是10