水泡性口炎诊断技术.docVIP

ICS 11．220 B 41 N Y 中华人民共Sn国农业行业标准 NY／T 1 188—2006 水泡性口炎诊断技术 Diagnosis techniques for vesicular stomatitis 2006—07—10发布 2006—10一01实施 中华人民共和国农业部发布  NY／T 1 188—2006 刖 置 水泡性口炎(VS)是由弹状病毒科的水泡性口炎病毒(VSV)引起的马、牛和猪的一种水泡性疾病， 被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病，我国将其列为二类疫病。本病临床上与口蹄疫、猪水泡 病、猪水泡疹很难区别，主要表现为口唇部有水泡、溃疡、糜烂，影响采食，导致生长缓慢，影响经济效益。 OIE采用组织细胞、鸡胚、实验动物等方法分离水泡性口炎病毒，进一步用问接夹心酶联免疫吸附 试验(IS‘ELIsA)和补体结合试验(cF)对分离的病毒进行鉴定；在国际贸易中，OIE指定用液相阻断酶 联免疫吸附试验(LP—ELISA)、病毒中和试验(VN)和补体结合试验(cF)检测水泡性口炎血清样品。 本标准中水泡性口炎的病毒分离试验、IS—ELISA试验和病毒中和试验，是根据OIE{哺乳动物、 禽、蜜蜂A和B类疾病诊断实验和疫苗标准手册)(2000版)中的诊断技术以及国内近年来在水泡性口 炎方面的研究成果而制定的，其中病毒分离试验、IS-ELISA试验和病毒中和试验均与OIE的标准性文 件等效。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部动物检疫所。 本标准主要起草人：李其平、龚振华、陆明哲、郑增忍、郭福生、蒋正军、王海霞。  NY／T 1188—2006 水泡性口炎诊断技术 1范围 本标准规定了水泡性口炎(VS)的病毒分离鉴定试验、间接夹心酶联免疫吸附试验(IS—ELISA)和 病毒中和试验(VN)的技术要求。 本标准适用于水泡性口炎流行病学调查、临床诊断和实验室检测等。 2病原分离与鉴定 2．1病原分离 2．1．1器材 100 mL玻璃细胞培养瓶，恒温水浴箱，C02培养箱，超净工作台，倒置显微镜。 2．1．2试剂及溶液配制 MEM营养液，PBS缓冲液，犊牛血清，7．5％碳酸氢钠溶液，青霉素(104TU／mL)与链霉素(104mg／ mL)溶液，3％的谷氨酰胺溶液，Hanks液，灭菌生理盐水，0．25％胰蛋白酶溶液，缓冲甘油(pH 7．2～ 7．7)，配制方法见附录A。 2 1．3样品的采集 2．1．3．1采集发病动物口鼻部位的水泡皮和水泡液，水泡皮加人含50％甘油的PBS缓冲液中，水泡液 置于含2％犊牛血清和5％葡萄糖的灭菌生理盐水中，冷藏送检。保存液的体积不能超过水泡皮或水泡 液体积的2倍。 2．1．3．2不能获得水泡皮和水泡液时，牛可用探杯采集食道／n因(OP)黏液，猪可采集咽喉拭子，置于无 血清的细胞培养液中，冷藏送检。无血清细胞培养液的体积不能超过黏液或咽喉拭子的2倍。 2．1．4样品的处理 2．1．4．1将水泡皮剪碎，研磨，悬浮于5倍体积的pH7．2、0．2 mol／L的PBS缓冲液中(含青霉素1 000 IU／mL、链霉素l 000mg／mL)，4℃浸渍16h-20h，以3000 r／min离心15rain，取上清液，用O．2m微 孔滤膜过滤。 2．1．4．2将水泡液、OP液、棉拭子浸液加青霉素至1 000IU／mL、链霉素至1 000mg／mL，离心，取上清 液，用0．2舯微孔滤膜过滤。 2．1．5细胞接种 2．1．5．1将2．1．4的样品1mL接种长成单层的VERO细胞、BHK一21细胞或IB—RS一2细胞，37℃吸 附1 h，中间摇动一次。 2．1．5．2加入9 mL维持液，37*(3、5％C02培养箱中培养。 2．1．5．3每天观察细胞病变效应(CPE)，连续观察3天。 2．1．5．4如果细胞出现圆缩、聚集、固缩、脱落等病变，则进一步按方法2．2进行病原鉴定。盲传3代 无病变者按2．1．8处理。 2．1．6鸡胚接种 2．1．6．1将鸡胚卵置于蛋架上，气室朝上，以碘酒、酒精棉球消毒气室，用剪刀去除气室部蛋壳。 2．1．6．2用无菌眼科镊子撕去一小片内壳膜，在绒毛尿囊膜上滴入2．1．4中的样品0．2mL。 2．1．6．3用无菌脱脂棉撕成薄片盖住蛋壳，用蜡封口，于37℃孵育。 1  2．1．6．4如果鸡胚2天内死亡，鸡胚周身呈明显充血、出血，尿囊膜肥厚，收获尿囊膜按2．2方法作进 一步鉴定。盲传3代无病变者按2．1．8处理。 2．1．7乳鼠接种 2．1．7．1将2．1．4的样品颈部皮下接种2日--7日龄乳鼠，每只接种0．2mL。 2．1．7．2每天观察乳鼠病变，连续观察5天。 2．1．7．3如果