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蛋白质测序技术 一、蛋白质一级结构的测定 蛋白质的一级结构是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性和生物学功能多样性的基础。 蛋白质的一级结构中除肽键外，有些还含有二硫键。 蛋白质一级结构 测定的原理 1.氨基酸组成的分析 (1) 蛋白质样品的纯化; (2) 蛋白质分子中多肽链数目测定 (3) 氨基酸组成的分析 蛋白质一级结构测定基本原则 1.确定蛋白质的纯度在97%以上。 2.测定多肽链的数目。 3.拆分多肽链。 4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。 5.鉴定多肽链的N—末端和C—末端氨基酸残基。 6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。 7.测定各肽段的氨基酸序列。 8.拼接各肽段成完整的多肽链。 9.确定二硫键的位置。 . . 用自动序列分析仪测序 仪器原理：Edman法。 1967液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。 1971固相测序仪 表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。 1981气相测序仪 用Polybrene反应器。 （聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 气相：5pmol 60 肽 98% 蛋白质序列仪的结构示意图 序列仪反应室的结构 20 种PTH氨基酸HPLC图谱 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 1、?? 二硫键的确定（对角线电泳法） 碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解蛋白质 第一向电泳 过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H 第二向电泳 分离出含二硫键的两条短肽，测序 与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。 样品蛋白质经硫氧还蛋白处理后，利用荧光巯基探针标记巯基，目标蛋白会带上荧光探针。再进行对角线电泳时，如果发现目标蛋白存在分子内二硫键，则经处理后所得的点位于对角线的上方；如果目标蛋白存在分子间二硫键，则经处理后得到的点位于对角线的下方。 2、?? 酰胺的确定 Asp（天冬氨酸） –Asn（天冬酰胺）、Glu（谷氨酸）-Gln 酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn 举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val- 此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。 3、?? 糖、脂、磷酸基位置的确定 糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -C-糖苷 脂类：Ser、 Thr（苏氨酸）、Cys（半胱氨酸） 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4) Arg-Thr-Leu-Ser(PO4) Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4) 序列测试时应注意的问题 一、与样品相关的因素 （1）样品纯度：90%, 盐含量在５０mmol/L内，不含变性剂（如SDS)等杂质，其N-端必须是均一的高纯样品。例如样品中含2个混合物，只有含量相差4-5倍以上才能对主序列和次序列进行分析。 纯度鉴定方法： A：质谱 B ：SDSC ：HPLC D ：HPCE 一般采用2种以上的方法加以验证。 （2）样品量： 至少需要10Pmol,例如标准蛋白质测定：10Pmol样品可以测定20氨基酸残基。 一般样品量大于50Pmol或者更多测定序列越长。如分子量为20000的蛋白质，50Pmol约为1微克。所以蛋白质N-端测序属于常规测定。 （３）样品存在状态 A 液体：液体样品中不能含有蛋白酶以防降解，同时样品测试前不能放置太久，在－20℃以下保存，最好尽早测试。 B 转膜样品：样品经凝胶电泳分离后，应马上进行电转移至PVDF膜上面，转膜前不能放置很久以防止样品扩散。 含有样品的PVDF可以用滤纸夹住保持在密封塑料袋中，可以在冰箱保存3-6个月。 （４）如果样品没有任何信号峰，要考虑蛋白N-端封闭。具报道约50%天然蛋白质N-端被修饰如乙酰化，甲酰化，焦谷氨酸化，须经蛋白质化学降解或酶切后分离后分析。 ??有时样品在分离纯化中也会产生N-端封闭，主要由于溶液中去垢剂或化学物质与蛋白样品N-端功能基团反应，或者分离纯化中PH过高（PH?9-10） 转膜样品要求： （１）为防止部分蛋白质在电泳过程被胶内杂质而封闭Ｎ末端，请预先自做预电泳。即用低电压跑空胶２－2.5h再上样电泳分离。 ??（２）电泳过程中，用尽量避免条带拖尾现象，用于测序的条带用狭窄清晰。而且必须保证一定的量，测定20个氨基酸以上的蛋白质，至少需要2-3条明亮，清晰的条带。 ??（３)样品转膜后请用Coomass