兰段玉友刘岳龙.PDF

维普资讯 嚣。～ 第14卷第1期 中 国 病 毒 学 voI14 No 1 1999年 3月 VIROLoGICA SIN[CA M ar． 1999 用 PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组 DNA 兰 段玉友 刘岳龙 2 6I‘ (括州大学畜牧兽医学院动医系，括州 2250O9) S 占·；，j三 摘 要 根据已发表 的序列．分别在鸡贫血病毒 (CAV)环形基因组 DNA(全长 23kb)的EcoRI位 点和BamHl位点的两侧选择适当序列合 成两对 弓I物，用 PCR技术 ，从斑点杂交检测到病毒核酸的 CAV感染的 MDCff~RPI细胞基因组 DNA 中．分别扩增 出包含 EcoRI和 BamH[分割开 的病毒基 因组西部分 (1．5kb和 08kb)约 I．5kb和约 125kb的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进 pUC18载体，获得包含 CAV全基因组序列 DNA片段的克隆质粒 pCAV24。酶切分析表明，该质 粒具有预期的 BamHI位点、Pst[位点、HindⅢ位点．而预期 的EeoRI位点消失。重组质粒插入 DNA片段的两端序列分析表明．质粒 pCAV24是包含 CAV全基因组序列的重组质粒．插入 DNA 片段序列中的EcoRl位点序列发生了一个碱基突变。 关键词 鸡传染性贫血病毒．基因组 DNA，聚台酶链式反应，克隆 … 一 R 一 自Yuasa等…报道鸡贫血病毒 (CAV)以来，世界各地均陆续证 明了该病毒感染的普遍 性。CAV属于一个新的病毒科——圆环病毒科 j。这是一种无囊膜的呈二十面体的小病毒， 直径只有 20nm左右。CAV 的基因组是一条只有 2．3kb的单股环状 “一”链 DNA j．只产生 一 个转录子 ．可编码三个蛋 白质，即衣壳蛋 白VP1及其相关蛋 白VP2、细胞凋亡 因子 VP3 。 CAV的致病性在于通过 CAV编码产生的细胞凋亡因子造成的细胞程序性死亡l5J，主要是造 血细胞和淋 巴细胞的程序性死亡，进而造成感染鸡 的贫血，出血及免疫抑制。在野外．感染 CAV几乎不引起典型的临床症状．但 由于 CAV的免疫抑制作用，CAV感染群易并发或继发 其它疾病，以及常 I起疫苗免疫失败等情况。CA／的亚临床感染严重影响着养禽业的经济效 益_6】．然而至今仍没有理想的预防CAV感染的方法。国外将 CAV基因组双拷贝串连在一起 克隆进载体质粒后．所得到 的重组质粒 DNA转染 MDCC-MSB1细胞后可产生传染性 的 CAVC1 这就有可能用基因工程的方法构建出能在体 内蔓制的无致病性 CAV毒株。为了尝 。 试构建这样的毒株用作疫苗株，本研究用 PCR技术成功地扩增和克隆了鸡贫血病毒全基因组 DNA。 1 材料与方法 11 材辩 I．1．1 引物 引物 1：5CATGATGAA ACTA3 引物 2：5CATGATGGATCCCTCATTCq~AGTG3 引物 3：5CATGATCGCCAAGATCTCTGTGAACC G3 收稿 日期：1998—01—18．修回日期：1998—06—18 维普资讯 第 1期 陈为民等：用 PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组 DNA 81 引物 4：5CATGATGCATGCGAGCGAAGTCGAGCGATTCGTCC