第12章核酸的物理化学性质(王).ppt

第十二章 （二）碱水解 水解特点： RNA的磷酸酯键易被碱水解产生核苷酸；而DNA对碱稳定。 （三）酶水解 核酸酶（nuclease) 1.核酸酶的分类 （1）按底物专一性分 核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA 脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA。 （2）按对底物作用的方式 核酸内切酶(endonuclease) 核酸外切酶(exonuclease) 既可内切也能外切的核酸酶 (1) 在3′-OH与磷酸基之间断裂 (2) 在5′-OH与磷酸基之间断裂 2．核糖核酸酶类 （1）牛胰核糖核酸酶（RNaseI或 RNaseA ） 作用于RNA，十分耐热，内切酶，其作用点为：嘧啶核苷-3′-磷酸与其他核苷酸之间的连键，产物为3′-P-嘧啶核苷酸。 3．脱氧核糖核酸酶类 (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel) ： 此内切酶切断双链DNA或单链DNA成为以5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸。需镁离子(或Mn2+，Co2+)，最适pH 7-8。 (2)牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡ) ： 此酶降解DNA成为3’-磷酸末端的寡聚核苷酸。最适pH 4～5，需0.3 mol／L钠离子激活，镁离子可以抑制此酶。 （3）限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（通常为回文序列），并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 在细菌中发现有这类酶，主要是降解外源的DNA。具有很严格的碱基序列专一性，是基因工程最重要的工具酶。 1．碱基的解离 腺嘌呤的解离 2. 核苷的解离 由于戊糖的存在,影响核苷中碱基的解离． 核糖的羟基也能解离，但PK值大于12，一般不考虑． ３.核苷酸的解离 核苷酸的两性解离和等电点 　由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子。磷酸基所带负电荷正好与含氮环所带正电荷的数目相等，这时的pH即为此核苷酸的等电点 pI = (pk1’+pK2’)/2 三、核酸的紫外吸收 可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经溴化乙锭染色在紫外灯下粗略地估计其含量。 核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为增色效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收） 核酸复性后ε(P)值又降低，这现象称减色效应。 （一）变性(denaturation) 　变性指核酸在某些理化因素作用下，双螺旋区的氢键断裂，变成单链，解开成两条单链的过程。 1、引起核酸变性的因素 热变性：加热到80～100℃ 酸碱变性 化学试剂：尿素 、甲醛、甲酰胺 DNA的热变性和解链温度（Tm） 用加热的方法使核酸变性叫做热变性。 DNA的变性过程是爆发式的，它在很窄的温度区间内完成。 DNA熔解温度或熔点：通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为，用Tm 表示。 一般DNA的Tm值在82-95?C之间。 影响DNATm的因素： （1）DNA的均一性。均质DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、 poly(G-C) 的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；因它在变性时的氢链断裂几乎可“齐同”进行，故要求的变性温度更趋于一致。异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。 （二）复性 (renaturation) 复性时间与基因组大小的关系 复性的过程基本符合二级反应动力学。 Cot l/2 ：衡量复性反应快慢 衡量复性反应的速度快慢的指标 Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示， t为时间，以秒表示， Cotl/2表示复性一半的Cot值 2.杂交的应用类型 （１）Southern 印迹(Southern blotting) （2）Northern印迹（Northern blotting） 1979年，发展出了一种新的方法，将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。这种方法同DNA印迹杂交技术十分类似。 （3） Western 印迹（Western blotting） 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做Western蛋白质杂交技术。 本章基本要求 在pH7.0时；DNA的 ε(P) 为～6600, 　　 　　　　　RNA的 ε(P) 为7700～7800。 单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸的ε(P)值要高。 测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。 增色效应和减色效应 DNA的紫外吸收光谱