第12章激光共聚焦显微镜术.ppt

二、用Snarf-I定量定比例测定pH值 1．染色方法 （1）将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。 （2）加入Snarf-I AM，终浓度1~5μmol/L，在37℃孵育30~60min。 （3）用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍后进行LSCM观察。 2．储存液 将BCECF溶于DMSO溶液，浓度1mmol/L，避光－20℃保存。 三、用Indo-I测量细胞内Ca2+ Indo-I（分子量840D），标记活细胞内Ca2+，常选用Indo-I AM，其分子量为1010D，呈干燥的白色粉末。 1．染色方法 （1）将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。 （2）加入Indo-I AM，终浓度1~5μmol/L，在37℃孵育30~60min。 （3）用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍后进行LSCM观察。 也可用弱去垢剂如Pluronic F-127助染。将Pluronic F-127溶解于DMSO配成20%（W/V）的溶液，用时终浓度为1%~2%。 2．储存液 将Indo-I溶于DMSO溶液，浓度1mmol/L，避光－20℃保存。 四、用Fluo-3测定细胞内Ca2+ Fluo-3分子量855D，染细胞内Ca2+常用Fluo-3 AM，其分子量为1130D，橙色粉末。 1．染色方法 （1）将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。 （2）加入Fluo-3 AM，终浓度1~5μmol/L，在37℃孵育30~60min。 （3）用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍后进行LSCM观察。 也可用弱去垢剂如Pluronic F-127助染。同上。 2．储存液 将Fluo-3 AM溶于DMSO溶液，浓度1mmol/L，避光－20℃保存。 五、用CFDA测定细胞间通讯 1．染色方法 （1）将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。 （2）加入CFDA溶液，终浓度1~5μmol/L，在37℃孵育10~15min。 （3）用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍后进行LSCM观察。 2．储存液 将CFDA（6-carboxy-fluorescein-diacetate）溶于DMSO溶液，浓度1mmol/L，避光－20℃保存。 六、用DiBAC4测定细胞膜电位 （1）将培养细胞用DiBAC4孵育，终浓度2~5μmol/L，在37℃孵育10~15min。 （2）进行LSCM观察时，注意实验中要将DiBAC4的胞外浓度与胞内一致。如果细胞去极化，比如增加介质的KCI浓度10~15μmol/L，DiBAC4荧光强度升高。 七、用罗丹明123（Rhodamine123）标记活细胞的线粒体 （1）将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。 （2）加入Rhodamine123，终浓度1μmol/L，在37℃孵育15~30min。 （3）用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍后进行LSCM观察。 八、用吖啶橙（AO）标记DNA和RNA （1）培养细胞用95%酒精固定10~15min，干燥，1%醋酸分化30s。 （2）0.01%AO染色5~10min。磷酸缓冲液（pH=4.8）洗1min。 （3）1/10mol氯化钙分化30s或数分钟，水洗后进行LSCM观察。 九、用碘化丙啶（PI）标记DNA （1）将培养细胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗两遍。 （2）弃上清液留0.5ml，用PBS将细胞密度调整为1×106/ml。 （3）加入RNase 0.5ml（5mg/50ml），在37℃消化30min。 （4）取出放入冰浴中，加入1.5ml PI（5mg/100ml），染色至少30min。 （5）用200目尼龙网过滤后进行LSCM观察。 2．细胞CT 共聚焦成像利用照明点与探测点共扼这一特性，可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，不仅可获得普通显微镜无法达到的分辨率，同时具有浓度识别能力及纵向分辨率，因而可看到较厚生物标本的细节。它以一个微动步进马达控制载物台上下步进移动，其最小步距可为0.1μm，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对生物样本进行无损伤的光学切片，得到各层面的数