提要本研究以三种赤潮藻，赤潮异弯藻（heterosigmaakashiwo）共生甲.doc

三种赤潮藻多克隆抗体制备 及特异性分析* 孙宁波 隋正红 包振民 王春燕 (中国海洋大学海洋生物遗传学与种质工程实验室, 青岛 266003) 中国是全球受赤潮危害较重的国家之一（周名江等，2001），随着现代化工农业生产的迅猛发展，沿海地区人口的增多，大量工农业废水和生活污水排人海洋，导致近年来赤潮的频繁发生和规模的不断扩大，严重破坏了渔业资源和海产养殖业，并威胁着人类的生命安全。中国海岸线较长，引起赤潮爆发的藻种种类多样，赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、共生甲藻（Symbiodinium sp）、链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）等藻种是常见的赤潮藻，危害较为严重，也是目前研究较多的主要赤潮藻，如何及时、精确、快速地对赤潮藻进定性、定量分析对于预报赤潮的发生、以及赤潮的检测研究均有重要意义和参考价值。 传统的赤潮藻定性、定量鉴定主要是通过光学显微镜方法(Hallegraeff et al.,1995)，此方法费时、费力，对一些个体微小的藻类难以做出准确鉴定（Rehnstam-holm,et al.,2002），因此发展新的检测技术成为赤潮研究的紧迫之需。Caron等(2003)用浮游金藻(Aureucoccus．anophagefferens)成功制备出高特异性的单克隆抗体与多抗血清，并对两者进行了多方面的特性分析。Nakanishi等利用单克隆抗体制作免疫传感器定量研究Chatonell marina,可检测100～10000ind/ml密度。向军俭等（2003）制备了５种赤潮藻单克隆抗体，以抗体为基础的免疫检测方法克服了人为因素的影响，具有定性和定量的准确度。 本文作者制备了３种不同粒径的赤潮藻-赤潮异弯藻、链状亚历山大藻、共生甲藻的多克隆抗体，采用间接酶联免疫法检测抗体的效价，采用竞争酶联免疫法检测多克隆抗体的特异性，为进一步的的开拓赤潮准确定性、定量检测具有。μmol/m2·s，采用14h：10h (L/D)的光暗周期，所用新西兰纯种兔由青岛市药检所提供。 2.实验方法 １）免疫原的制备 将生长旺盛的藻细胞培养液用终浓度为2%的甲醛固定过夜，10000r/min，离心10min，收集藻细胞沉淀。藻细胞团块用蒸馏水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通过离心收集藻细胞，离心条件均为10000r/min，离心10min。将收集的藻细胞分装于1.5ml 试管中，甩去残余水分，-20℃保存备用。临用前取出，用灭菌的PBS重新悬浮均匀后方可使用。 2）多克隆抗体制备 开始免疫之前将处理好的藻细胞用0.5ml PBS重悬，混匀，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，乳化程度尽量完全。家兔通过四肢的腋下注射、背部皮下多点注射的方式进行免疫。初次免疫剂量分别为共生甲藻为1×107个、链状亚历山大藻1×107 和2×105个和赤潮异弯藻1×107个细胞，加强免疫过程中，除佐剂换为弗氏不完全佐剂和免疫剂量减半外，其它步骤不变。免疫原为等体积的PBS藻细胞悬液和弗氏佐剂的混合物，每间隔十天加强免疫一次，共注射80d。利用肥达氏反应测得两种抗体的效价后，放血，收集血液，4℃静置血块收缩, 2000r/min，离心5min ,　提取血清，-20℃保存备用。 3）封闭吸附处理 取赤潮异弯藻抗血清100μl，加900μl无菌PBS稀释，依次与108个塔玛亚历山大藻、108个共生甲藻的细胞混合，放置于20℃振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min, 离心10min，收集上清，保存备用；按照类似的方法，换用共生甲藻的抗血清与108个塔玛亚历山大藻、108个赤潮异弯藻的细胞混合放置于20℃振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min离心10min，收集上清，保存备用;换用链状亚历山大藻的抗血清与108个赤潮异弯藻、108个共生甲藻的细胞混合放置于20℃振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min离心10min，收集上清，保存备用。 4）抗血清效价的测定 抗血清效价的测定主要采用间接酶联免疫法（（亓海刚等，2006）。 海藻或海藻粗提液包被(105~106ind/m1)，100 μl / 孔，4℃湿盒过夜；洗板，用0.5%PBST洗3次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体；封闭，用1%的BSA，包被缓冲溶液稀释，120μl/孔，37℃，3h或者4℃过夜；洗板，0.5%PBST洗3次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体；加入海藻的多克隆抗体梯度稀释溶液，100μ1/孔，37℃，1.5h ；再洗板，用0.5%PBST洗6次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体；加入酶标二抗的稀释溶液，100μl/孔，37℃，1.5h：洗板，0.5%