第七章细胞培养本章目标.PDFVIP

第七章 细胞培养 本章目标 1.掌握单细胞的分离方法。 2.掌握细胞悬浮培养和单细胞培养方法。 植物细胞培养是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞或小细胞团进 行培养，形成单细胞无性系或再生植株，或生产代谢产物的技术。它不仅揭示了 高等植物细胞方面的重大理论问题，而且在实践上已被广泛地应用到一些研究和 生产领域。 第一节 单细胞培养 单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细 胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。 一、单细胞的分离 在细胞培养中，即可从植物器官、组织中分离单细胞，也可以从愈伤组织中 分离单细胞。常用的分离方法有： （一）机械法 叶组织是分离单细胞的最好材料。目前最常用的方法是先把叶片轻轻研 碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。具体做法是： 1.称取10g新鲜叶片，进行表面清洗消毒后，放入研钵中。 2.加入40ml研磨介质(20μmol/L蔗糖+10μmol/LMgCl2+ 20μmol/L Tris-HCl缓冲液)轻轻研磨成匀浆。 3.将匀浆用双层细纱布过滤. 4.滤液经过低速离心，将滤液中细微的碎屑除掉，游离细胞就会沉降到试管 底部，得到纯化细胞。 （二）酶解法 利用果胶酶、纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞，这种方法不仅能 降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以用酶解法分离细胞时，必须对细胞给予 渗透压保护。 具体做法是： 1.果胶酶的制备 0.5%果胶酶+0.5%葡聚糖硫酸钾+0.8%甘露醇，配成20ml，调节PH为5.8， 用孔径为0.2-0.4um的滤膜过滤灭菌。 2.取刚长出的嫩叶用70%乙醇漂洗数秒，用饱和漂白粉上清液浸泡15min， 无菌水冲洗4-5次。吸干表面的水分，用消过毒的镊子撕去叶的下表皮。 3.用消过毒的解剖刀将叶片切成3cm见方的小块，取2g切好的叶片放入装 有果胶酶液的三角瓶中。 4.用真空泵抽气1 min -2min，使酶渗入细胞间隙。 5.将三角瓶置于低速转床上，转速为120r/min,温度25℃-28℃，30min后， 吸取酶液，碎片。 6.再放入上述果胶酶20ml，保温振荡30min，吸取酶液，此酶液主要含有海 绵组织细胞。 7.再次放入上述果胶酶20ml，保温振荡30min，用纱布或尼龙网过滤除去被 消化的叶脉和表皮。 8.在100g条件下离心2min，吸取上清液，底层即得均一的栅栏组织。 （三）由愈伤组织分离单细胞 将未分化、易碎散的愈伤组织转移到装有适当液体培养基的三角瓶中，然后 将三角瓶置于水平摇床以80r/min～100r/min振荡培养，获得悬浮细胞液。用孔 径200μm 的细胞筛过滤，除去大块细胞团，再以4000r/min速度离心，除去比 单细胞小的残渣碎片，获得纯净的单细胞悬浮液。 二、单细胞的培养 单细胞的培养方法有看护培养、平板培养和微室培养等。 （一）看护培养法 用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个 细胞，并使其生长和增殖的方法。此法简单易 行，易于成功，但不能在显微镜下直接观察细 胞生长过程。 具体方法是： 1.把含琼脂的培养液加到小三角瓶中，使 成1cm厚，高压灭菌后备用。 2.在无菌条件下，取处于活跃生长期的约 2 1cm大小的愈伤组织块，安放在三角瓶中固体 培养基上的中央部位，并在愈伤组织块上放一 2 片约1cm 的无菌滤纸片，将其在培养 室中放置过夜，使滤纸充分吸收从组织块渗 图7-1 应用看护培养法建立单细胞无性系 出来的营养成分。 3.然后将分离出的单个细胞接种到滤纸上面进行培养。 培养基和愈伤组织供给单细胞营养使细胞能持续分裂形成细胞团。一般1 个多月后，单细胞可分裂成为肉眼可见的愈伤组织小块，待2~3个月后即可从滤 纸上直接转移到新鲜培养基上，得到单细胞无性系。 （二）平板培养法 把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层（1mm）在培养皿 底上的培养方法。平板培养是为分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上 的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、