Desmin基因exon6 A360P错义突变及克山病关系.docVIP

Desmin基因exon6 A360P错义突变及克山病关系 　 作者：张洁　刘作功　郭雄　赖江华 【摘要】 　　目的 探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法 采用临床流行病学方法调查，随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者、病区正常组和非病区正常组各30例血样，提取基因组DNA，采用PCR扩增、酶切、电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果 慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变位点。结论 Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。 【关键词】 克山病； Desmin基因；易感基因； 　　克山病与扩张性心肌病(dilatedcardiomyopathy, DCM)的主要病理变化均为心肌的变性、坏死、纤维化(替代瘢痕)，最终导致心脏功能失代偿 [1]，两病在心肌病理学变化、临床症状体征上均缺乏特异性的鉴别诊断指标[2]。近年来已发现一些与DCM相关的基因突变，如细胞骨架蛋白基因(desmin、dystrophin、lamin A/C、δsarcoglycon、Metavinculin等)和心肌肌小节成分蛋白基因(Actin、atropomyosin、Troponin T、βMHC、Titin、cMyBPC、MLP等)[34]。国内报道[5]克山病患者心肌组织中Desmin荧光染色明显异常，离病灶越近Desmin改变越明显，且与病程成正相关，以慢型克山病多见。已知desmin基因的多个突变中，exon6错义突变与DCM相关性较大，但与慢型和潜在型克山病的关系仍不明确。为此，本调查采用PCR和凝胶电泳的方法检测慢型和潜在型克山病患者中是否存在与DCM患者相同的desmin基因exon6错义突变，以寻找可能的鉴别诊断指标。 　　1 材料与方法 　　1.1 调查对象与分组 选取陕西省黄陵县店头镇各乡296例、非克山病病区西安市长安区 30例为调查对象，依据中国《克山病诊断标准》(标准编号：GB1702121997)，检出慢型和潜在型克山病患者 82例，临床表现主要有心律失常、多发性室早、房颤等 ，其中慢型克山病患者占4.7% (14例)，潜在型患者占23.0% (68例)。随机抽取克山病患者组30例(病例组)，病区内正常对照组30例(内对照组)。非病区正常对照组30例(外对照组)。方差分析病例组与其他两组年龄和性别没有显著性差异。 　　1.2 样品采集与处理 使用含知情同意书的统一调查表进行调查后，采集肘静脉血5mL，EDTA抗凝，冰块保存运输，置-25℃冰箱低温保存。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 外周血DNA的制备 血样采用盐析法制备DNA，用于做PCR扩增和基因突变的酶切分析。 　　1.3.2 Desmin基因突变位点与引物序列选择 Desmin的基因组DNA全长11990bp，有9个外显子，其中exon6的突变类型为A360P位点错义突变，exon6上、下游引物序列来源于文献[6] ，分别为5′CCTCTCCTGCAGAACGATTC3′；5′TCCTGCCTGGCCCCTCAC3′。含exon6的片断长度为250bp，如果在基因组DNA的6211位点发生A360P错义突变，则用内切酶Bsp1286I可将该片断切开为两个分别为184bp和66bp的片断[7]。为保证实验体系及内切酶的有效性，特设定内对照。选择内切酶Bsp1286I，将desmin基因序列输入相应软件中，可看到酶切位点在5407，而5407位点位于exon4片段内，故用PCR扩增exon4片段，可被Bsp1286I切为长度分别为60bp、122bp两个片断。Exon4的引物来源于文献[7]，序列为5′AAGCCCAGTCATGCCCTACA3′， 5′CTTCGACTTGTACCACTCCTCAGC3′。 　　1.3.3 Desmin基因PCR扩增步骤 标准的PCR反应体系： 20μL模板DNA为200ng 基因组DNA，TrisHCL(pH8.4) 20mmol/L、KCl 50mmol/L、MgCl2 1.5mmol/L、dNTP各50μmol/L，正反义引物各0.2μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5u 。PCR反应条件：94℃变性30s ；57℃退火30s ；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，循环30次。对PCR扩增的基因片断exon6及内对照 exon4选用限制性内切酶Bsp1286I进行酶切。 　　1.3.4 琼脂糖凝胶电泳及银染 配制1.5g/L琼脂糖用于电泳，50V电压，电泳20-40min。 　　1.3.5 分析、比较各组酶切