Midkine mRNA在食管鳞癌患者外周血中表达及其临床意义.docVIP

Midkine mRNA在食管鳞癌患者外周血中表达及其临床意义 　;作者：胡俊,田小强,商延芳,刘飞,刘全俊,黄培林【摘要】; 目的:探讨靶基因中期因子(MK)在食管鳞癌患者外周血中的表达及其与食管鳞癌生物学行为的关系。方法:采用巢式RT?PCR方法检测54例食管鳞癌患者外周血的MK mRNA。10例正常健康志愿者外周血为阴性对照，11例食管鳞癌肿瘤组织为阳性对照。结果:54例食管鳞癌患者外周血MK mRNA阳性率为61.11%(33/54)，并与食管鳞癌患者淋巴结转移有显著相关性(Plt;0.05)，而健康成人外周血则无一例出现阳性。结论:应用巢式RT?PCR方法检测食管癌患者外周血中的MK mRNA具有较高的敏感性和特异性，它有望成为判断食管鳞癌恶性程度、转移、复发和监测疗效的客观指标。 【关键词】; 中期因子;食管鳞癌;外周血;肿瘤标志物;生物学行为 研究表明，恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就有癌细胞入血，即微转移（micrometastasis），它是肿瘤的恶性标志和主要特征之一，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因之一。因此，早期诊断肿瘤微转移是提高恶性肿瘤治疗效果、改善患者预后的有效途径之一[1?2]。而巢式RT?PCR可在1times;107个单个核细胞中检出1～10个肿瘤细胞，其敏感性、特异性远高于其他方法[3]。迄今为止，国内外尚未见食管鳞癌患者外周血中期因子(midkine，MK)mRNA表达情况的研究报道。本研究拟用巢式RT?PCR方法检测食管鳞癌患者外周血的MK mRNA表达，并探讨其与食管鳞癌生物学行为的关系。 　　1; 材料与方法 　　1.1; 材料 　　1.1.1; 样本; 54例食管鳞癌患者均为东南大学附属中大医院胸外科2004~2006年的住院患者，所有病例均经病理确诊；男40例，女14例；年龄46～83岁，平均63.4岁。取术前患者外周血3ml。以11例食管鳞癌肿瘤组织标本为阳性对照，10例健康志愿者外周血为阴性对照。 　　1.1.2; 试剂; 淋巴细胞分离液和DEPC为南京生兴生物技术有限公司产品，Trizol试剂、RT?PCR试剂盒及Taq酶等为日本TaKaRa公司产品。 　　1.1.3; 引物; 参照有关文献，采用Primer5引物设计软件自行设计，所有引物均由江苏百龙基因有限公司合成。引物序列见表1。 　　表1; beta;?actin和MK基因的引物序列（略） 　　Tab1; Primer sequences of beta;?actin and MK 　　1.2; 方法 　　1.2.1; 样本处理及总RNA提取; 抽取术前患者外周静脉血3ml，以枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法常规分离单个核细胞。肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。Trizol一步法分别提取总RNA20mu;l，将提取的RNA于紫外分光光度计上定量，并行1?0%琼脂糖凝胶电泳，以明确RNA未降解。 　　1.2.2; 逆转录合成cDNA和PCR扩增; 所有标本各取5mu;l RNA，70℃6min变性，根据TaKaRaRNA试剂盒进行cDNA第1链合成，行MK巢式PCR。第1轮PCR：取cDNA5.0mu;l，10times;PCRbuffer2.5mu;l，25mmol·L－1MgCl20.5mu;l，10mmol·L－1dNTP0.5mu;l，10pmol·L－1第1轮PCR上、下游引物各2.5mu;l，TaqDNA聚合酶1.25U，加灭菌水至25mu;l。反应条件：94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃60s，30个循环；72℃5min延伸。第2轮PCR：取第1轮PCR产物2.0mu;l作模板，加10pmol·L－1第2轮PCR上、下游引物各2.5mu;l，除退火温度改为53℃外，余反应体系及反应条件同前。选择beta;?actin基因作为内参照质控指标。PCR反应中加入其上、下游引物各2.5mu;l，扩增条件除退火温度改为56℃外，余反应体系及反应条件同前，但只进行1轮扩增。 　　1.2.3; RT?PCR产物鉴定; 将第1轮PCR产物双向测序，并取第2轮MK PCR产物及beta;?actinPCR产物各5mu;l加样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压80V，电泳约25min，然后用紫外光凝胶成像系统扫描并拍照。在相应位置(531、272bp)出现肉眼可见条带判为阳性(图1)。MK产物带272 bp，beta;?actin产物带531bp 　　M.Marker；1.肿瘤组织阳性对照；2.健康捐献者外周血阴性对照；3～7.患者外周血 　　图1; 3种标本PCR产物琼脂糖凝胶电泳示例（略） 　　Fig 1; Example of three kines of PCR produc