Survivin基因真核表达载体构建及其在cos-7中表达.doc

Survivin基因真核表达载体构建及其在cos-7中表达 　 作者：李红　李明红　杨桦　镡旭民 【摘要】 　　［目的］克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。［方法］ 以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivin cDNA。将该基因克隆到pcDNA3.0载体中,构建真核细胞表达载体pcDNA3.0/survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7，Western blot检测survivin蛋白在cos-7中表达。［结果］ DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Western blot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为16.5kD。［结论］ Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。 【关键词】 survivin基因　人喉癌组织　基因表达 　　Construction of Survivin Eukaryotic Expression Vector and Its Expression in cos-7 Abstract: ［Purpose］ To clone and express human survivin gene with eukaryotic vector. ［Methods］ Total mRNA was extracted from human laryngeal cancer tissue, and then the full-length survivin cDNA was obtained by RT-PCR. The surivin gene was cloned into pcDNA3.0 vector and the pcDNA3.0/survivin vector was constructed and transfected into cos-7 cells. The survivin protein was analyzed by western blot. ［Results］ The cDNA of survivin was sequenced and consistent with the sequence reported in Genebank with blast。 Western blot analysis demonstrated that the survivin protein was expressed and the relatived molecular mass was about 16.5kD. ［Conclusions］ survivin gene has been cloned and expressed successfully and can be used for further study the applications of survivin on diagnosis and therapy in the laryngeal cancer. Key words: survivin gene; eukaryotic expression; vector construction Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成员，其功能主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻断细胞凋亡过程。该蛋白选择性地表达于胚胎发育组织和人类大多数肿瘤组织，而正常成人终末组织中不表达，其独特的分布特点在肿瘤发生、发展过程中的重要作用已受到学者们的广泛关注。为了进一步探讨该基因在人喉癌组织中的表达及其在喉癌诊断及预后判断中的作用，我们构建了survivin基因的真核表达载体并将其转染cos-7细胞以观察该基因在其中的表达情况，为下一步喉癌的诊断和治疗提供新的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材 料　 人新鲜喉癌组织、pcDNA3.0质粒和猴成纤维细胞cos-7细胞系及DH5α菌株均为本科保存。限制性内切酶及胰蛋白酶购于宝生物工程(大连)有限公司；T4DNA连接酶、DNA纯化试剂盒和逆转录试剂盒购于Promega公司，用于组织总RNA提取的Tripure Isolation Reagent提取试剂盒购于Gibco公司。转染试剂Lipofectamine Reagent 2000和G418购于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗体购自于Santa cruz公司。 1.2 方 法 1.2.1 PCR引物设计　 根据Gene Bank中s