略论PCR-DGGE技术在中草药栽培及药理探究中应用.docVIP

略论PCR-DGGE技术在中草药栽培及药理探究中应用 　［摘要］ 目的 探讨PCR-DGGE技术在中草药栽培及药理研究中的应用。方法 采用PCR-DGGE技术对中草药生长的不同时期或不同土壤环境中的微生物群落的结构组成进行检测，分析环境中微生物种类、组成比例等因素的影响，同时配合其他指标的检测。结果 中草药药理的研究较前可以更加透彻、深入。结论 该技术在药物栽培和药理研究领域中应用的前景十分广阔。　　［关键词］ PCR-DGGE; 中草药药理；中草药栽培；环境微生物 　　中国传统医学历史悠久，既是中华五千年文明之瑰宝，亦是世界医药花园中的奇葩。其中中草药是中医治疗中最为重要的应用手段之一，中草药与几乎中医学的治疗过程都密不可分。而中草药的药理学特性更是中药研究的核心。但很多药材，甚至可以说大多数药材的药理学特性并没有被完全的掌握，尤其是一些稀有的药材。这些药材之所以稀有和珍贵，根本原因在于它们不能够进行移栽或人工培养，强行进行移栽，只会使它们的药理学或者是生理学特性发生改变，因此，为疾病的中医治疗带来了困难。中草药的药理学特性的产生其实与其所生长的环境条件密不可分。温度、水分、光照、土壤成分等很多因素都会对其生长产生影响，但即使这些环境条件都满足的情况下，某些药材的移栽和人工培养仍然不能够成功，其原因极有可能是环境中微生物因素造成的。微生物因素亦会对药材的药理学特性产生重要的影响。而土壤环境中微生物因素的影响在过去的技术水平下，是很难完全研究清楚的。因此，相信这也是中药栽培以及药理产生研究的重要障碍。变形梯度凝胶电泳技术（DGGE）是在含有浓度线性递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，将长度相同的双链DNA因其碱基排列的不同而分离［1］。即通过因不同微生物的DNA分子结构的差异使不同微生物的特异性DNA条带分开，再经过分析、割胶回收条带、测序、序列搜索比对等步骤测定环境中微生物种类、优势组成、数量比例等项目，进行环境微生物研究。从1993年开始将DGGE 应用微生物生态学研究，DGGE技术便迅速的发展起来，这项技术应用于微生物生态学只有10多年历史，目前却被广泛应用于环境微生物的检测中。 　　DGGE技术在土壤［2］、水体［3］、发酵食品等［4］环境的微生物多样性和微生物群落变化等方面的应用，多与其他分子生物学技术（如PCR技术）手段相结合，产生了PCR-DGGE等技术。PCR-DGGE在微生物群落结构研究中，日渐发挥着巨大作用。该技术可以对中草药生长的不同时期或不同的土壤环境中的微生物群落结构组成进行检测，其操作简单，并可同时测定多个样品。假如使用该技术来作为中草药栽培以及药理学研究的辅助手段，可以使研究更加深入、透彻。本文通过研究查阅国内外大量文献资料以及结合笔者等PCR-DGGE应用技术积累的经验，针对于药材土壤环境中的微生物群落应用DGGE分析的主要步骤、常见问题试做简单介绍，以提供参考。 　　1 样品处理 　　DNA的产率高低直接决定DGGE条带的代表性。产率低，其条带的代表性就差。而环境样品处理的好坏，决定了DNA产率的高低。我们对于土壤样品，一般采取修改后的Bead-Beating法［5］。称取10 g土样，放入盛有数粒无菌玻璃珠（直径3～5 mm）的三角瓶中，加15 ml提取缓冲液。在180 rpm，37 ℃条件下振荡30 min，加2 ml 20%SDS继续振荡10 min。65 ℃水浴1 h后6000 g离心15 min，收集上清液，加0.5倍体积PEG (30%)-NaCl(1.6 mol/L)，混匀后室温下静止2 h，在10000 g离心20 min，沉淀用 2 ml TE重新悬浮。加4 mol/L NaCl至终浓度0.3 mol/L，用酚-氯仿-异戊醇抽提1次，0.6倍体积异丙醇沉淀2 h，12000 g离心20 min，沉淀干燥后，200 μL TE溶解，经纯化后，-20 ℃保存。 　　2 PCR扩增 　　在PCR扩增中，引物的选择、扩增程序和PCR 产物的质量都会造成群落结构的分析偏差。因此PCR扩增效率必须保证。 　　2.1 引物的选择 为完整提取环境样品中的DNA所以一般采用5端连接了GC夹结构的通用引物，来扩增环境中微生物的16SrDNA的某一序列，引物分上游引物和下游引物两种，可以根据不同需要自行选择或设计。 　　2.2 扩增程序 由于扩增的目的DNA片段的不同，扩增程序会稍有不同，但一般都是采用梯度PCR经过预变性循环、退火恒温循环、延伸等几个步骤。PCR扩增中要注意，模板DNA的量是有一个适宜范围的，质量浓度应在5 ng/μl。PCR反应体系的药品添加一定要在冰盒上进行，而且速度要快。另外，扩增时的程序选择，必须选Lid heat。 　　2.3 扩增后的产物检查 可进行琼脂糖凝胶