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离体毛囊切片两种制作方法比较及凋亡检测
离体毛囊切片两种制作方法比较及凋亡检测
【关键词】 体外培养
摘要:目的 对人头皮游离毛囊(HF)切片制作及凋亡检测方法进行比较。方法 分别将石蜡切片法和冰冻切片法应用于游离毛囊;利用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行荧光染色与3,3′二氨基联苯胺(DAB)染色, 检测未经培养的游离毛囊及培养5d的游离毛囊的不同部位凋亡细胞情况。结果 在对游离毛囊形态检测中,各组毛囊在外根鞘(ORS),毛球(HB)下部,真皮鞘(DS)及毛乳头(DP)中的凋亡细胞数并无显著性差异(Pgt;0.05)。结论 冰冻切片法应用于游离毛囊简单有效, TUNEL原位荧光结合DAB染色适合于检测毛囊细胞凋亡情况。
关键词:毛囊;体外培养;凋亡
Comparison of two methods of section making and detection of apoptosis method on human scalp hair follicle in vitro
ABSTRACT: Objective To compare two methods of section making and to detect the apoptosis on human hair follicle(HF) in vitro. Methods The paraffin section and frozen section methods were used. The TUNEL[fluorescence staining and 3, 3′Diaminobenzidine(DAB) staining] was used to investigate the apoptotic cells of different parts when the hair follicles were uncultured and cultured on 5th day. Results The process of making frozen section was more simple and feasible on single hair follicle. The apoptotic index of outer root sheath(ORS), lower part of hair bulb(HB), the dermal sheath(DS) and dermal papilla(DP) of every groups had no difference(Pgt;0.05). Conclusion The method of frozen section was more feasible on the section making of single hair follicle. The TUNEL with fluorescence staining and DAB staining was suitable for the detection of apoptotic status of hair follicle.
KEY WORDS: hair follicle; culture in vitro; apoptosis
毛囊的凋亡现象与毛囊的周期性生长关系密切。虽然与毛囊相关的生物学研究广泛开展,但对毛囊凋亡的系统研究仍不多。以往对生长期与休止期毛囊凋亡现象的探讨主要以定性讨论为主。在本实验中,我们试图采用原位末端标记技术对不同部位毛囊细胞的凋亡情况做一描述。以前的研究中我们曾采用冰冻切片机进行了游离毛囊切片的制作,显现出有别于石蜡切片的优越性[1]。在本实验中,我们还试图比较石蜡切片法与冰冻切片法在毛囊细胞凋亡检测中的优缺点。
1 材料与方法
1.1 人头皮游离毛囊培养模型 标本来源于整形外科除皱头皮切口周边头皮(年龄18-45岁)。培养基成分和模型构建参见文献[2]。
1.2 游离毛囊冰冻切片的制作 游离毛囊分为未经培养的游离毛囊和培养5d的游离毛囊两组,每组12个毛囊。在倒置显微镜下选取无损伤的游离毛囊,固定后,200g/L蔗糖溶液浸泡24h,在-29℃下,先将样品盘上的冰冻包埋剂 (optimal cutting temperature, OCT)修出一平台,再用无损伤镊将毛囊以垂直刀口方向(毛球部朝向刀口)放在已修出的平台上,然后以OCT覆盖,冷冻10min后作4μm厚的冰冻切片,边切边在显微镜下观察,以便获得游离毛囊完整的中心纵剖面。
1.3 人头皮游离毛囊石蜡切片的制作 选取形态好的游离毛囊,用Bouin固定液固定30min,乙醇脱色,15g/L琼脂加热溶化并冷却到50℃时将组织放入浸泡, 待琼脂完全
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