第6章-互作蛋白质研究技术.pdf

Chapter VI Protein‐Protein Interaction Networks of ProteinNetworks of Protein--Protein InteractionProtein Interaction 蛋白质‐蛋白质相互作用(PPI)形式与方式 • 形式上 形成多亚基蛋白质的形成多亚基蛋白质的四级结构四级结构，如血红蛋白如血红蛋白4个亚基的装配个亚基的装配； 形成蛋白质复合体，如病毒外壳，核孔复合体等； 瞬时的瞬时的蛋白质蛋白质‐蛋白质相互作用，如蛋白质的翻译后修饰、磷酸化、乙蛋白质相互作用，如蛋白质的翻译后修饰、磷酸化、乙 酰化等。几乎参与细胞基本生命活动的全部过程。 •• 方式上方式上 结构域‐结构域相互作用。如蛋白质‐蛋白质复合体，抗原‐抗体等均属 于该类型；于该类型； 结构域‐肽相互作用。如某些病毒衣壳组装的相互作用，主要组织相容 性复合体‐抗原复合体相互作用； 分子内蛋白质‐蛋白质相互作用，即多结构域蛋白质分子内部头尾端不 同结构域之间的相互作用。如FERM蛋白质家族以及Tyr激酶Src等受这 种首尾作用调控种首尾作用调控。 蛋白质‐蛋白质互作的研究方法 • 离体（In vitro)‐将待研究的蛋白质分离后，在细胞外进行相互 作用分析的方法作用分析的方法。 蛋白质亲和层析（Affinity chromatography)； 核磁共振谱分析（Nuclear Maggnetic Resonance Sppectroscopy,py, NMR ）； 表面等离子共振（Surface plasmon resonance, SPR ）； 亲和印记（Far western ）； 蛋白质芯片（Protein microarray）; ‐‐‐‐‐‐ • 在体（在体（In vivo ））‐在细胞内进行蛋白质互作分析的方法在细胞内进行蛋白质互作分析的方法。 异种系统检测‐将待研究的蛋白质在异种细胞中表达后加以分析的方法。 ~细菌双杂交、酵母双杂交、哺乳动物细胞双杂交等。 基于活细胞的蛋白质‐蛋白质相互作用研究方法。 ~基于荧光共振能量转移显微技术、共聚焦显微技术、流式细胞分析 等。 蛋白质亲和层析(Affinity Chromatography) • 亲和层析是一种利用待分离分子与固定相配体的特异亲和结合 特性来分离分子的色谱方法，特性来分离分子的色谱方法，蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析，即利用发生相，即利用发生相 互作用的蛋白质分子之间存在这种特异的亲和力，从而达到分 离鉴定互作蛋白质的目的。 Prey Bait Sepharose 蛋白质亲和层析(Affinity Chromatography) • 优点： 11. 细胞裂解物中所有蛋白质都有机会与固定相上的诱饵蛋白质结合，细胞裂解物中所有蛋白质都有机会与固定相上的诱饵蛋白质结合，因此因此 可以检测裂解物中的所有蛋白质。 2. 由于诱饵蛋白质的浓度可以比正常细胞内的浓度高出几个数量级，从而 可以检测到微弱的相互作用。 3. 可以检测到多亚基之间的相互作用。 4. 可以分析蛋白质可以分析蛋白质相互作用的方式相互作用的方式。 • 假阳性结果: 1. 带不同电荷性质的蛋白质可能通过电荷间的相互作用而结合。 2. 间接的蛋白质相互作用。 3. 一些蛋白质在活细胞中由于些蛋白质在活细胞中由于区隔化区隔化不可能发生相互作用不可能发生相互作用，但在离体条件但在离体条件 下，有可能发生非天然的结合。 ~肌动蛋白（肌动蛋白（actinactin))和和DnaseDnase II 分别位于细胞质和细胞核中分别位于细胞质和细胞核中。 表面等离子共振技术(SPR) • 表面等离子共振 （Surface plasmon resonan